Como el coronavirus SARS Cov 2 sortea la acción del Interferón.

SARS-CoV-2 Orf6 hijacks Nup98 to block STAT nuclear import and antagonize interferon signaling. https://www.pnas.org/content/early/2020/10/22/2016650117

El coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo grave (SARS-CoV-2) es el agente causante de la pandemia de la enfermedad del coronavirus en curso 2019 (COVID-19) que es un grave problema de salud mundial. La evasión de la señalización antiviral mediada por IFN es una estrategia de defensa común que los virus patógenos utilizan para replicarse y propagarse en su huésped, es el mecanismo que le permite causar la infección.

En este estudio, mostramos que SARS-CoV-2 es capaz de bloquear eficientemente la translocación nuclear STAT1 y STAT2 con el fin de afectar la inducción transcripcional de genes estimulados por IFN (ISG). Nuestros resultados demuestran que la proteína accesorio viral Orf6 ejerce esta actividad anti-IFN. Encontramos que SARS-CoV-2 Orf6 se localiza en el complejo de poros nucleares (NPC) e interactúa directamente con Nup98-Rae1 a través de su dominio C-terminal para perjudicar el acoplamiento del complejo de carga-receptor (karyopherin/importin) y interrumpir la importación nuclear. Además, mostramos que una sustitución de metionina a arginina en el residuo 58 perjudica la unión de Orf6 al complejo Nup98-Rae1 y abolió su función antagónica IFN. En conjunto, nuestros datos desentrañan un mecanismo de antagonismo viral en el que un virus secuestra el complejo Nup98-Rae1 para superar la acción antiviral del IFN.

Los interferones (IFN) son citoquinas secretadas con fuertes actividades antivirales que constituyen un componente importante de la primera línea de defensa contra los patógenos invasores. Se clasifican en tres grupos, tipo I, tipo II y IFN de tipo III, en función de la estructura de sus receptores en la superficie celular (9, 10). Las IFN de tipo I, o IFN-I, pueden ser producidas por prácticamente cualquier tipo de célula nucleada, y la señal a través del receptor IFN de tipo I (IFNAR) expresado ubicuamente. El IFN tipo II, o IFN-II, es producido principalmente por células inmunitarias especializadas y señales a través del receptor ifN-γ (IFNGR) para sinergizar las respuestas innatas y adaptativas. Los IFN de tipo III, o IFN-III, se unen al receptor IFN—(IFNLR), que se expresa predominantemente en las células epiteliales que están presentes en superficies de barrera como las vías respiratorias y gastrointestinales. Los IFN de tipo I y de tipo III son inducidos al detectar diferentes patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) por diferentes familias de receptores de reconocimiento de patrones (PRR) y desencadenan una respuesta antiviral muy similar. Tras la unión del receptor, ambos activan la cascada de señalización JAK-STAT que conduce a la fosforilación y activación de STAT1 y STAT2, que se asocian con IRF9 para formar el complejo de transcripción del factor genético estimulado por IFN 3 (ISGF3). ISGF3 es importado al núcleo por el heterodimero de karyofrina alfa 1 (KPNA1)-karyopherin beta 1 (KPNB1) (11). Específicamente, las cariofínas se unen a las señales de localización nuclear expuestas en el complejo ISGF3 y median su translocación citoplasmática-nuclear a través de interacciones con proteínas del complejo de poros nucleares (NPC) llamado nucleoporinas o Nups. Una vez en el núcleo, ISGF3 se une a elementos de respuesta específicos estimulados por IFN (ISRRE) en el ADN para desencadenar la transcripción de genes estimulados por IFN (ISG) y el establecimiento de un estado antiviral. Por el contrario, la señalización JAK aguas abajo de IFNGR conduce a la fosforilación y homodimerización de STAT1. Los complejos homodémeros STAT1 se translocan en el núcleo como se ha descrito anteriormente y regulan la expresión de un subconjunto de ISG mediante la unión a elementos promotores de sitio activados por gamma (GAS).

El papel de las IFN y la cinética de la secreción de IFN en el contexto de la infección con coronavirus altamente patógenos siguen estando completamente aclarados. Como se describe en pacientes con SRAS, se han detectado niveles bajos de IFN, acompañados de altos niveles de quimioquinas, en la sangre y los pulmones de pacientes con COVID-19 grave (5). Sin embargo, se ha observado una firma elevada de IFN en el lavado broncoalveolar (BAL) de algunos pacientes graves (8). Además, en un modelo de ratón de infección por SARS-CoV-2, la señalización IFN-I parecía ser necesaria para la inducción del ISG y para el reclutamiento de células proinflamatorias en el pulmón, pero no era eficaz para controlar la replicación del virus (12), lo que indicaba que SARS-CoV-2 podría ser resistente a la señalización IFN, como se ha demostrado anteriormente para el SARS-CoV (6). Esto es probablemente debido a los sofisticados mecanismos que los coronavirus han evolucionado para evadir y suprimir la respuesta IFN (13⇓⇓–16). Por ejemplo, se sabe que los coronavirus bloquean la producción de IFN protegiendo sus intermedios dsRNA de replicación dentro de vesículas de doble membrana (17) o modificando el ARNm viral para evitar el reconocimiento por PRR específicos (17⇓–19). Además, se ha demostrado que múltiples proteínas del betacoronavirus antagonizan la señalización IFN (20⇓⇓⇓–24) o funciones de efector ISG (25, 26). Por ejemplo, se demostró que la proteína no estructural Nsp1 de SARS-CoV disminuye los niveles de fosforilación de STAT1 (22); las proteínas accesorias Orf3b y Orf6 parecían inhibir la producción y señalización de IFN bloqueando la translocación nuclear de factores de transcripción (20, 21); y el SARS-CoV-2 codificado papaína-como proteasa antagoniza la acción del gen inducido por IFN ISG15 (27).

En este estudio investigamos la capacidad de SARS-CoV-2 para antagonizar la señalización IFN. De acuerdo con estudios recientes, encontramos que SARS-CoV-2 es sensible al pretratamiento de IFN (28). Además, demostramos que la infección viral es capaz de inhibir la importación nuclear STAT para perjudicar la inducción transcripcional de los ISG. Como se muestra con SARS-CoV (21), y más recientemente con SARS-CoV-2 (23, 24), la expresión de la proteína accesoria viral Orf6 es suficiente para inhibir la translocación nuclear STAT. Mecánicamente, demostramos que la proteína accesoria Orf6 se localiza en el NPC donde se une directamente al complejo Nup98-Rae1 para mediar en esta inhibición. De hecho, una proteína Mutante Orf6 defectuosa en la unión Nup98 pierde por completo la capacidad de bloquear la translocación nuclear STAT. Además, mostramos que la interacción entre Orf6 y Nup98 da lugar a un acoplamiento ineficiente de complejos de receptores de carga en el NPC. La subversión de la vía de señalización IFN probablemente promueve la replicación no verificada de SARS-CoV-2 in vivo y contribuye a la inmunopatología

Los coronavirus altamente patógenos han desarrollado múltiples estrategias para suprimir la respuesta IFN y replicar con éxito en las células huésped. En este estudio, demostramos a una resolución de una sola célula, que la infección SARS-CoV-2 inhibe fuertemente la señalización IFN tipo I y tipo II bloqueando la translocación nuclear STAT1 y STAT2 (Fig. 3) para amortiguar la inducción del ISG (Fig. 4). La localización nuclear de STAT1 y STAT2 se desencadena por su homoilización mediada por tirosina fosforilación (mediada por IFN-II) y la heterodimerización (IFN-I- y IFN-III mediadas) (47). Los homodómeros STAT1 y los heterodémeros STAT1-STAT2 son transportados al núcleo por el complejo KPNA1-KPNB1, que es necesario para acoplar el complejo de importación al NPC (48). Anteriormente se propuso que el SARS-CoV bloquee la señalización IFN a través de una inhibición mediada por nsp1 de fosforilación STAT1 (22) y un bloque dependiente de Orf6 de translocación nuclear STAT1 (20, 21). Nuestros datos demuestran que la infección por SARS-CoV-2 sólo afecta marginalmente a la fosforilación STAT1 y STAT2(Fig. 2 C–E),lo que sugiere que el virus se dirige principalmente a factores del host que son más aguas abajo en la vía para bloquear la señalización IFN. Queda por determinar si SARS-CoV-2 nsp1 es responsable de la disminución observada de la fosforilación STAT1. Sin embargo, de acuerdo con informes recientes (23, 24), constatamos que la expresión ectópica de la proteína accesoria SARS-COV-2 Orf6 fue capaz de alterar el tráfico nucleocitoplasmático STAT y suprimir la expresión génica dependiente de ISRE en respuesta al IFN-I recombinante (Fig. 5). Por lo tanto, a pesar de tener sólo 69% identidad de aminoácidos, SARS-CoV y SARS-CoV-2 Orf6 pueden antagonizar eficazmente la señalización IFN. Se ha demostrado que muchos virus se dirigen a las vías de transporte del host con el fin de subvertir las respuestas antivirales innatas y promover la replicación viral (14, 49, 50). Sin embargo, los mecanismos explotados por los diferentes virus parecen ser diversos. Mientras que el poliovirus (PV) y el rinovirus humano (VDH) desencadenan la degradación proteolítica de varios nucleoporinas (Nups), incluyendo Nup98, la infección por el virus de la encefalomiocarditis (EMCV) y el mengovirus provoca cambios en su estado de fosforilación (51⇓⇓⇓–55). La proteína VP24 del virus del Ebola (EBOV) se une a KPNA1 para interrumpir la formación del complejo pSTAT1-KPNA1 mediado por IFN y evitar la translocación nuclear STAT1 (56). Además, VSV M inhibe la exportación de ARNm celular formando un complejo con Rae1 y Nup98 (41, 57). Por último, como se mencionó anteriormente, se ha propuesto que SARS-CoV Orf6 ate uní KPNA2 y secuestraMENTE KPNB1 a la membrana ER con el fin de bloquear el transporte STAT1 al núcleo (21). Aquí mostramos un mecanismo de antagonismo viral en el que un virus secuestra el complejo Nup98-Rae1 para evitar la importación nuclear STAT. Al igual que VSV M, SARS-CoV-2 Orf6 también forma un complejo con Nup98 y Rae1 (Fig. 6). Aquí mostramos que esta interacción parece interrumpir el acoplamiento de los complejos cargo-KPNA1-KPNB1 en el NPC (Fig.7A). Esto es consistente con su capacidad para apuntar a la vía de importación nuclear y para retener STAT1 y STAT2 fosforilados en el citoplasma. Basada en la estructura de VSV M con el complejo Nup98-Rae1, la proteína VSV M se une a Nup98-Rae1 a través de su dominio globular y a través de una región de dedo extendida (40). Específicamente, el dedo de VSV M se une a la interfaz de Nup98 y Rae1, con su residuo Met51 reconociendo un bolsillo hidrófobo en el lado de la hélice beta Rae1 y los segmentos ácidos enriquecidos vecinos que interactúan con ambas proteínas. La región C-terminal de Orf6 se asemeja al dedo del VSV M, con el residuo crítico Met58 flanqueado por residuos ácidos. Mientras que Orf6 probablemente se une a Nup98-Rae1 de una manera similar al dedo del VSV M, Orf6 carece de la otra interfaz mediada por el dominio globular del VSV M. Dado que el sitio de karyopherin beta 1 está cerca del sitio de enlace Rae1 en Nup98, es posible que la unión ORF6 a Nup98 interrumpa el acoplamiento de KPNB1 en Nup98, como indican nuestros resultados. Además, la proteína VSV M y el complejo Nup98-Rae1 se encuentran tanto dentro del núcleo como en el complejo de poros nucleares (41, 58), mientras que Orf6 se encuentra principalmente en el citoplasma y en el NPC (Fig. 6 C–E). Por lo tanto, si bien no podemos excluir que al interactuar con el complejo Nup98-Rae1 Orf6 también pueda tener un efecto en la exportación de ARNm, es probable que las diferencias enumeradas anteriormente contribuyan a efectos distintos de estas proteínas en el transporte nuclear. Este es un tema interesante para futuras investigaciones.

En particular, una proteína mutante Orf6 (sustitución de metionina a arginina en el residuo 58) deficiente en la unión Nup98 (Fig. 6A) no suprimió la expresión génica dependiente de ISRE y la translocación nuclear de STATs (Fig. 7 B y C). Curiosamente, esta proteína mutante Orf6 todavía era capaz de interactuar con KPNA1 y KPNA2 (SI Apéndice, Fig. S7 C y D), sugiriendo que aunque la interacción Orf6-KPNAs puede contribuir a la retención de STAT1 y STAT2 en el citoplasma, no es suficiente para conducir este fenotipo. Además, mostramos que la sobreexpresión de Nup98 es capaz de revertir completamente el bloque mediado por Orf6 de la importación nuclear de TLAT(Fig. 7D). En conjunto, estos datos demuestran que Orf6 es un potente antagonista de IFN y que la unión Nup98 es fundamental para la inhibición mediada por Orf6 de la señalización IFN. Además de bloquear la translocación nuclear STAT, la perturbación observada por Orf6 de la importación nuclear también podría afectar a otras cargas DE KPNB1 y dar lugar a la alteración de una gama más amplia de redes de señalización. A este respecto, se ha demostrado recientemente que SARS-CoV-2 Orf6 también puede suprimir la activación del IRF3 a través de su cola C-terminal (24). Sin embargo, aún queda por determinar si la unión Nup98 es necesaria para esta inhibición. De acuerdo con estos hallazgos, nuestro análisis scRNA-Seq sobre células Vero E6 sugiere fuertemente que las células infectadas productivamente con SARS-CoV-2 no montan una respuesta transcripcional comparable a las células espectadoras o simuladas cuando se estimulan con IFN-I o IFN-II(Fig. 4 y Si Apéndice, Fig. S4). Es importante destacar que nuestros datos también muestran que la infección por SARS-CoV-2 desencadena una reducción drástica del contenido total de ARN en las células infectadas en comparación con las células no infectadas o transeúntes(Fig. 4B). Esto sugiere fuertemente que la infección viral da lugar a una extensa desregulación transcripcional y supresión del gen del huésped que probablemente se deba a la acción combinada de múltiples factores virales, incluyendo Orf6. Sin embargo, es probable que la supresión mediada por Orf6 de la señalización IFN en tejidos infectados promueva la replicación viral y desempeñe un papel importante en la patogénesis del COVID-19. Por lo tanto, será importante en un futuro próximo abordar la contribución de Orf6 a la patogénesis in vivo del SARS-CoV-2.