Estrategias para mejorar la eficiencia de reparación genómica dirigida a la homología de los sistemas CRISPR-Cas

Las CRISPR, acrónimo en inglés de Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, o Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas y Regularmente Espaciadas, se producen en el genoma de ciertas bacterias, de las que el sistema fue descubierto. Mientras que el Cas9 es una endonucleasa asociada a CRISPR (una enzima), conocida por actuar como “tijeras moleculares”, que corta y edita, o corrige, en una célula, el ADN asociado a una enfermedad. Un ARN guía dirige las tijeras moleculares Cas9 al lugar exacto de la mutación. Una vez que estas tijeras moleculares hacen un corte en el ADN, los mecanismos celulares adicionales y el ADN añadido de forma exógena utilizarán la maquinaria de la propia célula y otros elementos para “reparar” específicamente el ADN.

La tecnología CRISPR-Cas9 puede ofrecer la capacidad de modificar o corregir directamente los cambios asociados a la enfermedad subyacente en el genoma, y tiene un gran potencial en medicina,

El español Francis Mojica, científico de la Universidad de Alicante, fue el primero en estudiar las secuencias CRISPR, a las que él mismo puso nombre. Fue allá por 1993, cuando comenzó a estudiar un microorganismo con una tolerancia extrema a la sal encontrado en las costas de Santa Pola (Alicante).

En concreto, el CRISPR es una región del ADN de algunas bacterias que actúa como un mecanismo inmunitario frente a los virus, es decir, las bacterias que sobreviven al ataque guardan la información de este agresor. Cuando el virus vuelve a atacar, la bacteria identifica los genes indeseables gracias a la información ya almacenada y esta memoria le permite destruir el virus. Según el científico José Miguel Mulet, “la tecnología CRISPR nos permite un paso más adelante ya que nos permite editar el ADN del propio organismo”. Esto puede suponer una gran ventaja en el caso de enfermedades genéticas, ya que “muchas veces son debidas a cambios mínimos en la secuencia y esta técnica permite corregirlos”,

“Hay 230 enfermedades que son consecuencia de una anomalía genética, y gracias a los maravillosos y revolucionarios avances en la comprensión del genoma humano sabemos qué parte de su estructura genética es la responsable”, explica en esta entrevista el jefe mundial de innovación de Bayer, Kemal Malik. ”Lo que podemos hacer con la tecnología CRISPR es reemplazar el ADN erróneo por ADN bueno”,

El Dr. Sharp cree que, por lo menos a corto plazo, los mayores efectos de la tecnología CRISPR se verán en el área de las enfermedades raras, cuyas consecuencias son asoladoras y no solamente terminan embarazos, sino que roban la salud a los niños y acortan el tiempo de vida. Al seguir el hilo de muchas de ellas, se llega a un solo defecto genético o “error tipográfico” en el genoma; es decir, estos trastornos raros y de un solo gen suelen entenderse bien a nivel molecular y permiten a los científicos predecir con más facilidad qué ocurrirá al manipular esa parte del código genético. De hecho, una compañía biotécnica con sede en Suiza piensa empezar hacia finales del 2018 un ensayo clínico del CRISPR en pacientes con trastornos sanguíneos raros como anemia de células falciformes y talasemia beta.

• Wenli Sol Hui Liu Wenhao Yin Jie Qiao Xueke Zhao Yi Liu

Introducción

El rápido desarrollo de la genómica funcional ha revelado y permitido recientemente la anotación de varios genes. Para descifrar la función de los genes, generalmente se emplean enfoques genéticos inversos, como la deleción, la inserción y la modificación, seguidos de la caracterización fenotípica.¹ Sin embargo, también se realiza un cribado aleatorio de mutagénesis para obtener los genotipos deseados (genética avanzada).² Recientemente, nuevas estrategias basadas en tecnologías precisas de edición del genoma, como las nucleasas de zinc,³ nucleasas efectoras similares a activadores de transcripción,⁴ y nucleasas CRISPR-Cas,⁵ han simplificado notablemente el proceso de identificación de genes.⁶

Las potentes herramientas CRISPR-Cas han permitido avances notables y cambios revolucionarios en las ciencias de la vida.

El sistema CRISPR-Cas9 de tipo II es la herramienta CRISPR-Cas utilizada principalmente; este sistema combina y corta los elementos genéticos extraños que reinciden a través de la guía del ARN CRISPR (CRRNA) y el ARNcr transactivado.⁷ Al explotar la interacción de emparejamiento de bases entre el arncr y el objetivo de ADN, la proteína Cas9 se ancla en un sitio de motivo adyacente al protoespaciador »NGG» y escinde específicamente las hebras de ADN,^5,8,9 generando roturas contundentes de doble cadena (DSB) que son perjudiciales para la integridad del genoma.^10,11

Sin una reparación oportuna y precisa, los DSB introducidos conducirán a riesgos graves, como reordenamientos cromosómicos, trastornos del desarrollo y muerte celular, que deben evitarse en los ensayos clínicos.^11,12 Según una extensa investigación, los efectos de la terapia génica dependen marcadamente de la eficiencia de las vías endógenas de reparación del ADN.¹³ Entre ellos, la unión final no homóloga (NHEJ)¹⁴ y reparación dirigida por homología (HDR)¹⁵ son las dos vías principales. NhEJ es predominante y principalmente propicio para el mantenimiento de la estabilidad del genoma, pero tiende a inducir inserciones y deleciones. Por el contrario, hdr produce resultados de reparación específicos en presencia de donantes de ADN. Por lo tanto, la terapia génica a través de HDR es más atractiva, ya que muchas enfermedades humanas son causadas por mutaciones genéticas dañinas. Los investigadores han estado trabajando para mejorar la eficiencia del HDR. Sin embargo, ninguna estrategia única es dominante, y se deben considerar múltiples factores.

En esta revisión, resumimos los factores que deben considerarse y destacamos las estrategias utilizadas actualmente para mejorar la eficiencia HDR de los sistemas CRISPR-Cas de acuerdo con tres características: regulación de los factores clave en las vías de reparación del ADN, modulación de los componentes en la maquinaria CRISPR y alteración de las condiciones intracelulares alrededor de los DSB. En particular, nuestro objetivo es discutir la influencia del entorno de cromatina del sitio objetivo y las modificaciones epigenéticas en los resultados de la edición del genoma, que a menudo se pasan por alto. Además, buscamos proporcionar soluciones potenciales para mejorar aún más la eficacia del HDR, lo que facilitaría el desarrollo de nuevas tecnologías CRISPR para lograr una edición del genoma altamente precisa en el futuro.

NHEJ versus la vía HDR

Las células sufren numerosas lesiones espontáneas de ADN de hasta 10⁵ por célula cada día, lo que conduce a la inestabilidad genómica, la muerte celular, el cáncer, etc.¹⁶ De hecho, ∼10% del daño en el ADN se puede atribuir a los DSB patógenos^17,18 sin reparación fiel, que es inducida por la exposición de las células a condiciones dañinas, como radiación ionizante, productos químicos radiomiméticos y especies reactivas de oxígeno.^13,14 Además, el uso de herramientas de edición del genoma puede generar DSB específicos del sitio.^19–21

Las células de mamíferos emplean cuatro mecanismos distintos para rescatarse de los DSB: NHEJ, HDR, unión final alternativa y recocido de una sola hebra. Entre ellos, NHEJ y HDR son las dos vías principales y competitivas de reparación del ADN.¹¹ NHEJ ocurre a lo largo del ciclo celular, mientras que HDR opera predominantemente en las fases S y G2.^11,22,23 A nivel molecular, la vía de elección se basa en la resección final del ADN,¹³ que se deriva del equilibrio entre los factores de protección final y los factores de resección final (por ejemplo, 53BP1-RIF1 y BRCA1-CtIP).^12,24

En la vía NHEJ, 53BP1 (proteína de unión a p53 1) se acumula en los DSB para prevenir la carga de BRCA1-CtIP y recluta al efector, RIF1 (factor de interacción RAP1 1), para restringir HDR.²⁴ Como un efector aguas abajo recientemente identificado de 53BP1-RIF1, el complejo shieldin bloquea la resección final del ADN y facilita el NHEJ. Sin embargo, el mecanismo molecular no está claro.²⁵ En el siguiente paso, dos heterodímeros Ku70/80 reconocen y se unen rápidamente a un DSB, uno para cada extremo del ADN, protegiendo en última instancia al DSB de la resección final.²⁶ Para proporcionar una condición favorable para la ligadura, Ku70/80 y las proteínas de andamio XRCC4 / XLF (factor similar a XRCC4 / XRCC4) vuelven a acercar dos extremos para formar un complejo sináptico que contiene las proteínas de unión NHEJ reclutadas.²⁵ A partir de entonces, la subunidad catalítica de la proteína quinasa dependiente del ADN (DNA-PKcs) desencadena una extensa cascada de señalización, incluida la estimulación de Artemisa. Debido a las actividades intrínsecas de la 5 exonucleasa y de la endonucleasa de 5′ a 3′, Artemis elimina los nucleótidos no coincidentes o dañados para exponer la microhomología para la ligadura posterior.²⁷ Alternativamente, los brazos microhomólogos se agregan mediante μ polimerasa (Polμ) y Polλ, que se reclutan para llenar los vacíos.^25,28 Finalmente, NHEJ es conducido por el complejo XRCC4-ligasa IV (XRCC4-LIG4), que es la única ligasa en esta vía, y puede ser estimulado por XLF.²⁹ En la Tabla 1 se proporciona un resumen de los principales factores eucariotas en la vía NHEJ.^12–14

Procesos NHEJ	Proteína	Impacto en la vía de reparación de elección	Casos para mejorar el efecto HDR	Aumento del HDR
Protección final	53BP1	Compite con BRCA1 en los OSD; protege los extremos del ADN; suprime la resección final del ADN	i53 inhibió la acumulación de 53BP1 en los DSB al ocupar su dominio Tudor en tándem	5,6 veces en diferentes células humanas y de ratón45
La coexpresión de una variante MEJORADA de RAD18 (e18) que tiene una mayor afinidad con H2AK15ub que 53BP1 puede promover el HDR mediado por Cas9	2 a 3 veces en los loci endógenos probados en HEK293T, HeLa, U2OS y hESCs57
La versión negativa dominante de 53BP1 (DN1S) se fusionó con Cas9, que compite o desplaza al 53BP1 endógeno, reduciendo el reclutamiento de efectores NHEJ	2 a 3 veces en las líneas celulares y loci genéticos probados52
RIF1	Efector 53BP1; protege los extremos del ADN; inhibe la resección mediada por BRCA1-CtIP
Synapsis	Ku70/Ku80	Une los extremos del ADN y los acerca; interactúa con DNA-PKcs; recluta otras proteínas NHEJ	La inhibición de Ku70 y Ku80 por siRNA aumentó la eficiencia HDR mediada por CRISPR-Cas9 en fibroblastos porcinos	2 veces en fibroblastos de cerdo131
XLF	Proteína de andamio
PAXX	Proteína de andamio
Fin del procesamiento	DNA-PKcs	Formación de un complejo sináptico con Ku70/80; autofosforilación; Activación de Artemisa	La inhibición de la actividad de la proteína quinasa por la mutación K3753R en el gen PRKDC, o el inhibidor transitorio, M3814, tiene un efecto comparable sobre el aumento de HDR	Promedio de 3.3 veces en la línea hiPSC46
Artemisa	Endonucleasa; Procesamiento final del ADN
Ligadura	LIG4	Ligadura de ADN	La coexpresión de las proteínas adenovirus 4 E1B55K y E4orf6, que median la degradación proteolítica de la ADN ligasa IV, suprimió eficientemente la vía NHEJ	5 a 8 veces en células HEK293 y células de linfoma de Burkitt de ratón42
Scr7 inhibió la función de la ligasa IV al dirigirse a su dominio de unión al ADN	de 4 a 19 veces en líneas celulares de mamíferos y ratones41,42,47
XRCC4	Andamio estructural LIG4; interactúa con Ku; une los extremos de ADN
XLF	Estimula la actividad de ligadura de LIG4

NHEJ, unión final no homóloga; HDR, reparación dirigida a la homología.

NHEJ es la vía preferida, en la mayoría de los casos, para reparar los DSB, y HDR solo ocurre en el suministro de donantes de ADN homólogos. Una vez que el complejo MRN exonucleasa de 3′ a 5′ (MRE11-RAD50-NBS1, llamado MRX por levadura)^30,31 y proteína de unión a C-terminal que interactúa con la proteína (CtIP)³² se unen a los DSB, se inicia el proceso de resección, lo que conduce a la generación de voladizos cortos de ADN monocatenario (ssDNA) de 3 ‘.^33,34 En colaboración con la proteína helicasa del síndrome de Bloom,³⁵ las nucleasas (incluyendo EXO1 y DNA2) ejecutan una resección extensa, que es esencial para la búsqueda de homología. Sorprendentemente, las quinasas de punto de control, ataxia telangiectasia mutaron,³⁶ La proteína relacionada con RAD3 y las quinasas dependientes del ciclo celular son responsables de las modificaciones post-traduccionales de los factores de resección. Los voladizos de ssDNA de 3′ se unen a la proteína de replicación A, que protege al ssDNA de la degradación nucleolítica y evita la formación de estructuras secundarias.³⁷ Con la ayuda de proteínas mediadoras, como la proteína de susceptibilidad al cáncer de mama tipo 2, la recombinasa de la familia RecA, RAD51, forma un filamento de nucleoproteína helicoidal en el ssDNA.³⁸ Este filamento puede interrogar el ADN dúplex intacto para una alta similitud de secuencia (es decir, homología).³⁹ Al identificar dsDNA homólogo, el filamento RAD51 invade el dúplex y se empareja con la hebra complementaria, que luego se utiliza como plantilla para la síntesis de ADN para extender el extremo 3′ de la hebra invasora. La hebra invasora luego se disocia, se extiende y luego es capaz de anneal con el voladizo ssDNA de 3′ en el lado opuesto del DSB (Tabla 2). Después de una mayor síntesis de ADN y ligadura de los nicks resultantes, HDR está completo. En particular, hay posibilidades más complicadas que involucran uniones holliday que pueden resultar en resultados cruzados. Sin embargo, tal discusión es tangencial a esta revisión.⁴⁰

Procesos HDR	Proteína	Impacto en la vía de reparación de elección	Fundas para mejorar el HDR	Aumento del HDR
Fin de la resección	CtIP	Inicia la resección final del ADN; detecta el ciclo celular; compite con 53BP1 en los OSD	CtIP de tipo salvaje o un fragmento N-terminal de CtIP se fusionó con Cas9	2 veces o más, dependiendo del ARN guía85,86
MRN (MRE11/ RAD50/ NBS1)	Resección de corto alcance; Eliminación de Ku70/80	El dominio N-terminal de UL12 (126 aminoácidos) se fusionó con Cas9, lo que resultó en el reclutamiento efectivo del complejo MRN a DSB	1.5- a 2.5 veces84
BLM	Resección de largo alcance; Helicasa
EXO1	Resección de largo alcance; 5′-3′ exonucleasa
ADN2	Resección de largo alcance; Helicasa; 5′-3′ exonucleasa
RPA	Proteína protectora de ssDNA de 3′
Invasión de strand	RAD51	Búsqueda de homología; recombinasa	RS-1 mejoró la actividad de unión de RAD51, estimulando la tasa de knock-in en el sistema de conejos	2-6 veces50
Un motivo (36 aminoácidos) codificado por BRCA2 Exon 27 (Brex27) se fusionó con SpCas9, enriqueciendo el RAD51 en los loci objetivo y estabilizando los filamentos de nucleoproteína RAD51/ssDNA	2 a 3 veces87
BRCA2	Proteína mediadora; Carga RAD51

Factores que influyen en la eficiencia del HDR

Las células de mamíferos suelen estar menos inclinadas a la reparación de DSB a través de la vía HDR debido a su baja eficiencia y falta de plantillas endógenas de reparación de ADN. Tres factores (Fig. 1) podrían ser vitales para la eficiencia HDR de los sistemas CRISPR-Cas, incluida la regulación de las proteínas clave en las vías de reparación del ADN, la optimización de los componentes en la maquinaria CRISPR y la alteración del entorno de cromatina celular y local cerca de los DSB.

Regulación de los factores clave en las vías de reparación del ADN

NHEJ y HDR son dos vías de reparación del ADN que compiten entre sí. En principio, la regulación de los factores clave en estas vías afecta a la eficacia del HDR (Tablas 1 y 2). Por un lado, la inhibición de los factores críticos en la vía NHEJ (por ejemplo, KU70/80, 53BP1, DNA-PKcs y ligasa IV) a través de la mutación genética, la inhibición de moléculas pequeñas o el reclutamiento bloqueado a DSB se han aplicado con éxito para mejorar el efecto HDR.^41–46 Por ejemplo, como un inhibidor de molécula pequeña, SCR7, se dirige al dominio de unión al ADN de la ligasa IV y afecta la afinidad entre la ligasa IV y los DSB, bloqueando la vía NHEJ. En 2015, tres estudios independientes demostraron que el uso de SCR7 puede promover HDR hasta 4-19 veces en líneas celulares de mamíferos y ratones.^41,42,47 Sin embargo, también se obtuvieron resultados controvertidos.⁴⁸ Cuando se empleó SCR7, no se encontró un aumento obvio en HDR en el locus pROSA26 en fibroblastos fetales porcinos⁴⁹ y el sistema del conejo.⁵⁰ Además, se observó una muerte celular grave en células madre pluripotentes inducidas por humanos en presencia de SCR7.⁵¹ Por lo tanto, se requieren más estudios para dilucidar el papel de SCR7. Cabe destacar que la inhibición global de factores clave en las vías de reparación del ADN podría resultar en toxicidad celular no discriminada. Por lo tanto, la inhibición de la NHEJ de manera transitoria o sólo en los OSD sería una alternativa más segura. Por ejemplo, Jayavaradhan et al. Fusionó Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) con una versión negativa dominante de 53BP1 (DN1S), que compitió con 53BP1 para unirse a los DSB, lo que finalmente dificultó el reclutamiento de factores secuenciales.⁵²

La modulación de factores clave en la vía HDR podría mejorar la eficiencia HDR. Por ejemplo, el uso de RS-1 mejoró la eficiencia HDR al estimular la actividad de unión de RAD51.⁵³ Además, con objetivos desconocidos, los medicamentos de moléculas pequeñas, L755507⁵⁴ y Brefeldin A,⁵⁵ se ha descubierto que aumenta la eficiencia del IDH entre tres y cinco veces.⁵⁶ Se ha encontrado que la regulación de los efectores en la respuesta al daño del ADN es efectiva. De hecho, Nambiar et al. encontró que la regulación al alza de la variante RAD18 diseñada (e18) mejoró significativamente el efecto HDR.⁵⁷ Cabe destacar que varios factores clave que intervienen en el HDR están sujetos a una regulación basada en SUMO en células de levaduras y mamíferos.⁵⁸ Por lo general, la SUMOilación tiene un efecto positivo general en la resección final. Por ejemplo, SUMO tiene una influencia funcional más fuerte en el homólogo humano Sae2, CtIP. Sin embargo, los mecanismos aún no se han identificado.⁵⁹ Además, se sugiere que sumoilación promueva la estabilidad de la proteína EXO1 en células de mamíferos a través de medios directos o indirectos.⁶⁰ Por lo tanto, especulamos que la manipulación de la SUMOilación de esos factores clave puede permitir una mayor eficiencia HDR.

Optimización de los componentes en la maquinaria CRISPR

Hay dos pasos esenciales para lograr una edición genética precisa a través de la vía HDR. La nucleasa CRISPR-Cas debe estar bajo la guía de un ARN de guía única (sgRNA) para inducir un DSB en los loci del gen objetivo. A partir de entonces, el sitio DSB se repara incorporando un donante de ADN exógeno. Por lo tanto, la nucleasa CRISPR-Cas, el sgRNA y el donante de ADN son indispensables. En principio, la optimización de estos tres componentes debería mejorar la eficiencia del HDR.

Hasta la fecha se han determinado varias estructuras para las nucleasas CRISPR-Cas,^61–64 proporcionando orientación para el diseño de variantes Cas con mayor fidelidad y especificidad. Por ejemplo, se construyó una «especificidad mejorada» SpCas9 (denominada «eSpCas9») mutando tres aminoácidos clave en el surco de la cadena no objetivo, atenuando la hibridación entre el ARN guía y el ADN no objetivo.⁶⁵ Además, se han creado varias otras variantes de Cas9, como Cas9-HF1 (variante de alta fidelidad número 1),⁶⁶ evoCas9 (variante cas9 evolucionada),⁶⁷ HypaCas9 (variante cas9 hiperprecisa),⁶⁸ y HiFi Cas9 (variante Cas9 de alta fidelidad),⁶⁹ entre otros. Kato-Inui et al. informó que las variantes cas9 diseñadas con umbrales más altos para puntos de control conformacionales pueden mejorar el efecto HDR en la edición de un solo nucleótido, así como la integración de fragmentos largos dentro de las células.⁷⁰ En particular, HypaCas9 mostró una mayor relación HDR / NHEJ hasta 6.9 veces en células HEK293T y 7.7 veces en células HeLa. Especularon que el umbral modulado de conformación alteró la cinética de la edición del genoma mediada por HypaCas9, lo que a su vez influyó en la interacción entre los DSB y los donantes de ADN. En conjunto, las nucleasas Cas diseñadas con alta fidelidad pueden lograr las máximas relaciones HDR/NHEJ.

En comparación con Cas9, varios estudios han indicado que algunos ortólogos Cas9 con baja orientación fuera de la orientación muestran una mayor eficacia HDR. Por ejemplo, Cas12a (anteriormente denominado Cpf1)^71,72 induce un sitio de escisión escalonada sobresaliente de 5 ′ lejos de la región de la semilla, lo que es beneficioso para la reparación mediada por NHEJ (Fig. 2A).^73,74 Al suministrar donantes de ADN, el ADN resultante de NHEJ se puede escindir y reparar repetidamente a través de HDR sin destruir los sitios de reconocimiento. Moreno-Mateos et al. aprovechó LbCa12a en lugar de SpCas9 para diseñar peces cebra, y encontró una eficiencia HDR sustancialmente mejorada.⁷⁵ Shahbazi et al. también entregó Cas12a a células madre y progenitoras hematopoyéticas utilizando una nanopartícula AuNP / CRISPR, lo que condujo a una eficacia HDR notablemente mayor.⁷⁶ Una de las ortólogas Cas9 más grandes, Francisella novicida Cas9 (FnCas9),⁷⁷ se encontró que muestra una especificidad extremadamente alta para los sitios objetivo, y predominantemente generó extremos pegajosos sobresalientes de 4 nt 5 ‘. Como resultado, la entrega de FnCas9 en células HEK293T con donantes ssODN mostró una mayor eficiencia HDR de 4,6 veces.⁷⁸

La entrega de sistemas CRISPR-Cas a través de virus adenoasociados es una de las estrategias más efectivas para su operación in vivo.⁷⁹ Sin embargo, la capacidad máxima (∼4,5 kb) del virus adenoasociado ha supuesto un revés para el empaquetado de los SpCas9 (∼4,2 kb) y los sgRNAs que normalmente se modifican o personalizan en un solo vector.^80,81 Por lo tanto, ortólogos Cas9 de menor tamaño (por ejemplo, Staphylococcus aureus Cas9,⁸⁰ CasX,⁸² y Casφ⁸³) podría ser beneficioso para la entrega eficiente y la edición del genoma.^64,81

Además de los métodos antes mencionados para la mejora de HDR, otra estrategia común implica la fusión de enzimas Cas u ortólogos con otras proteínas que desempeñan un papel crítico en las vías de reparación del ADN (por ejemplo, CtIP, MRN, 53BP1 y RAD51; Figura 2B). Los distintos mecanismos de estos factores para mejorar el IDH se resumen brevemente en los cuadros 1 y 2.^52,84–87 Las plantillas de ADN del donante están atadas a las nucleasas Cas para aumentar sus concentraciones locales. Por ejemplo, Savic et al. O enlazado⁶-oligos de ADN marcados con bencilguanina a proteínas Cas9 utilizando un enfoque de etiqueta instantánea, logrando una mejora de la eficiencia HDR de hasta 24 veces.⁸⁸ Además, Aird et al. ató las plantillas ssODN a las proteínas de fusión cas9-porcino circovirus 2 rep y observó un aumento de hasta 30 veces en la eficacia HDR⁸⁹ (Fig. 2C y D).

Para las ribonucleoproteínas Cas/gRNA (RNPs), se ha encontrado que la ingeniería de los ortólogos Cas9 y Cas9 mejora la estabilidad y especificidad de la orientación génica (Fig. 3A). Además, una serie de enfoques, como el truncamiento,⁹⁰ modificación química de sgRNA,^91–94 y construcción de sgRNA quimérico,⁹⁵ han sido aprovechados (Fig. 3B). Se ha encontrado que los tipos de ADN del donante (por ejemplo, plásmido de virus, ssODN, dsDNA y transcripciones inversas de ARN) desempeñan un papel importante en la vía HDR.^96–100 Por ejemplo, Richardson et al. reveló que las hebras de ADN escindidas se liberaron de los RNP Cas9 de manera asimétrica, donde la cadena de ADN no objetivo se expuso primero. Como resultado, el diseño racional de los ssODN específicos indujo hasta un 60% de mejora del HDR para las células humanas.⁹⁶ Más tarde, Bollen et al. indicó que el brazo de homología óptimo de ssODN es de 30–36 nt en el extremo 3′ y 67–91 nt en el extremo 5′.^98,101,102 Para los donantes de dsDNA, la introducción de partes adicionales, como la biotina, en los extremos de 5′ causó un efecto HDR significativamente mejorado, posiblemente debido al mantenimiento de la conformación de copia única de los donantes de ADN.⁹⁷ Sin embargo, la producción de donantes de dsDNA mediante la doble escisión de los plásmidos mediada por CRISPR dio como resultado una eficiencia HDR de dos a cinco veces⁹⁸ (Figura 3C).

Alteración del entorno de cromatina celular y local alrededor de los DSB

Los estudios han indicado que el ciclo celular adecuado y el estado de la cromatina son vitales para la reparación mediada por HDR.^18,22 Como HDR opera predominantemente en las fases media S y G2, los medicamentos de detención del ciclo celular son efectivos para mejorar la eficiencia de HDR. Yang et al. utilizó nocodazol y ABT para sincronizar células en la fase G2/M, lo que resultó en un aumento de tres a seis veces en la eficiencia HDR en células madre pluripotentes humanas, sin pérdida de pluripotencia y diferenciación.^103,104 Además de detener las células en etapas específicas, restringir la formación de DSB durante la fase del ciclo celular G1 no permisiva HDR aumenta de manera eficiente la precisión de la integración. Por ejemplo, Gutschner et al. fusionó una Geminina humana N-terminal a SpCas9, lo que resultó en una proteína de fusión diseñada denominada «Cas9-hGem». Esta variante de Cas9 es ubiquitinada por el complejo de ubiquitina ligasa E3, APC/Cdh1, lo que lleva a la degradación de Cas9 y una disminución de los DSB en la fase G1.¹⁰⁵ Como resultado, la actividad de Cas9-hGem durante las fases del ciclo celular predominantes en HDR mostró un aumento en la eficiencia hdr de hasta el 87%. (Fig. 4). Además, proteínas anti-CRISPR (Acr)^106–108 recientemente se descubrió que regulan la actividad de Cas9 de una manera controlable. Por ejemplo, Matsumoto et al. fusionó la proteína anti-CRISPR, AcrIIA4, con la región N-terminal de la licencia de cromatina humana y el factor de replicación del ADN1 (hCdt1), y logró la degradación específica de las proteínas a través de la proteólisis mediada por ubiquitina en la fase S/G2. Al coexpresar AcrIIA4-Cdt1 con spCas9, Cas9 está activo solo en la fase S/G2. Aprovechando este enfoque, no solo se observó una eficiencia HDR mejorada (aproximadamente cuatro veces), sino también una menor relación fuera del objetivo en múltiples loci objetivo en células 293A.¹⁰⁹

La edición del genoma mediada por CRISPR-Cas ocurre con frecuencia en contextos cromosómicos distintos, como la eucromatina y la heterocromatina.^110,111 Según la evidencia previa, las topologías cromosómicas tienen un impacto notable en la eficiencia de la edición del genoma.^112–114 Sin embargo, es difícil evaluar los factores debido a numerosas conformaciones de cromatina. Anteriormente, se encontró que la disminución en la unión a Cas9 por cromatina compactada y / o modificación del ADN daba como resultado una baja eficiencia de orientación génica de la heterocromatina.^115–117 Para investigar cómo la conformación de la cromatina influye en la edición del genoma mediada por Cas9, Chen et al. empleó un sistema TetR-KRAB para cambiar las conformaciones de cromatina en un sistema celular. Se sabe que la caja asociada a Krüppel (KRAB) recluta componentes de cromatina y remodelación de nucleosomas, como la proteína 1 asociada a KRAB (KAP1),¹¹⁸ proteína heterocromatina 1 (HP-1),¹¹⁹ CHD3,¹²⁰ y la histona metiltransferasa del dominio SET, SETDB1,¹²¹ en última instancia, proporcionar un entorno local permisivo que sea beneficioso para la vía HDR. En este caso, la vía NHEJ se ve obstaculizada por la heterocromatina, mientras que la vía HDR está menos influenciada, lo que resulta en un cambio de equilibrio de NHEJ a HDR.¹¹⁶ Janssen et al. sacaron conclusiones similares a Chen et al.¹²² En otro estudio, el estado de la cromatina se controló a través de la acetilación y desacetilación de histonas, que están reguladas por la histona acetiltransferasa y la histona desacetilasa (HDAC). En este estudio, se encontró que la inhibición de HDAC1 o HDAC2, pero no de otros HDAC, aumenta la tasa de NHEJ y HDR en aproximadamente dos a tres veces. A medida que los resultados se alinearon con observaciones anteriores, los investigadores plantearon la hipótesis de que los inhibidores de HDAC podrían abrir la cromatina y mejorar no solo la unión de la proteína Cas9, sino también la accesibilidad del ADN del donante al ADN objetivo.¹²³ En contraste, otros estudios indicaron que no hubo diferencias aparentes en la proporción eventual de HDR / NHEJ con respecto a los distintos estados de cromatina. Sin embargo, las regiones heterocromáticas se pueden editar con éxito disminuyendo la capacidad de búsqueda de Cas9.¹²⁴ Consistentemente, Kallimasioti-Pazi et al. indicó que la heterocromatina compactada influyó en la cinética en lugar del punto final de las nucleasas CRISPR-Cas9.¹¹⁴ Hasta la fecha, el mecanismo preciso de cómo las estructuras de cromatina influyen en el HDR mediado por Cas9 sigue sin estar claro.¹²⁵ La influencia del entorno de cromatina del sitio objetivo y las modificaciones epigenéticas en los resultados de la edición del genoma a menudo se han pasado por alto en revisiones anteriores sobre este tema. Sin embargo, estos factores deben considerarse en estudios futuros para mejorar aún más la eficiencia HDR de los sistemas CRISPR-Cas.

Conclusión

El HDR asociado a la nucleasa CRISPR-Cas se ha convertido en una herramienta útil para la edición precisa del ADN genómico. El editor base^126–128 y editor principal^129,130 (Figura 2D) se desarrollaron recientemente fusionando el dominio de unión al ADN de Cas9 (Cas9 muerto o dCas9) o cas9 nickasa a una enzima que cambia la identidad de una sola base de ADN objetivo. Los sistemas de editor base y editor principal son efectivos para la producción de mutaciones puntuales en ausencia de DSB. Aunque estas tecnologías son muy potentes, la reparación del ADN mediada por HDR tiene ventajas incomparables en diversas condiciones, como la reparación concurrente de múltiples mutaciones y la corrección de grandes inserciones y deleciones. Además, la eficiencia del HDR es menor que la del NHEJ en eucariotas, lo que limita su aplicación en tratamientos clínicos.

Los estudios en células de mamíferos han revelado que el deterioro de la vía NHEJ puede mejorar la eficiencia hdr.^{42,45–47,52,57,131} Observaciones similares se realizaron en la levadura de fisión, Schizosaccharomyces pombe,¹³² incluso sin el sistema CRISPR-Cas. Se podría argumentar que este enfoque es una estrategia universalmente eficaz para mejorar la eficiencia del IDH. Por lo tanto, los intentos anteriores de mejorar el HDR en levaduras pueden proporcionar pistas beneficiosas para mejorar la eficiencia de la orientación génica. El enfoque de «marcador dividido» también puede mejorar la orientación génica en ambos convencionales¹³³ y no convencionales¹³⁴ organismos modelo. La combinación de tales enfoques con las tecnologías CRISPR-Cas puede producir resultados sinérgicos.

En esta revisión, discutimos las estrategias de mejora HDR presentadas basadas en tres factores: regulación de los factores clave en las vías de reparación del ADN, modulación de los componentes en la maquinaria CRISPR-Cas y alteración del entorno intracelular alrededor de los DSB. Para cada aspecto, presentamos algunos de los avances y aplicaciones más recientes. Sin embargo, hay limitaciones que deben superarse. Por ejemplo, la mayoría de las estrategias se basan en condiciones biológicas y experimentales, lo que conduce a la falta de un enfoque dominante para que los investigadores lo sigan. Además, en revisiones anteriores sobre este tema, observamos que la influencia del entorno de cromatina del sitio objetivo y las modificaciones epigenéticas en los resultados de la edición del genoma a menudo se pasan por alto. En el futuro se deben considerar más factores para la mejora del HDR.

Aunque algunas de las estrategias propuestas funcionan bien bajo ciertas condiciones, el HDR altamente eficiente sigue siendo un valor atípico. Para lograr la promesa de la edición terapéutica del genoma, se podrían desarrollar metodologías de administración más eficientes. En el futuro, el desarrollo de métodos todo en uno que combinen las ventajas de diferentes enfoques probablemente será la opción óptima. Por ejemplo, nuestro grupo está desarrollando actualmente un método que combina los méritos de las tecnologías CRISPR-Cas9 y siRNA para obtener el mejor rendimiento en HDR. En general, esperamos que esta revisión sea valiosa para los investigadores en el campo de la edición del genoma. También creemos que pronto se desarrollarán herramientas científicas basadas en HDR para aplicaciones clínicas eficaces.