El sistema CRISPR-Cas ha revolucionado el campo de la edición del genoma, permitiendo la rápida generación de modelos de enfermedades y el desarrollo de estrategias terapéuticas para enfermedades genéticas y no genéticas.
Este número especial proporciona una interesante colección de artículos originales y de revisión sobre el uso de la tecnología CRISPR-Cas para el modelado de enfermedades (ver páginas 40 y 53) y terapias (ver páginas 66 y 95), posibles inconvenientes (ver páginas 19 y 80) y optimización (ver página 40) de las tecnologías ACTUALes de CRISPR-Cas, así como nuevas herramientas de edición del genoma (ver páginas 31 y 109).
El sistema de nucleasa CRISPR-Cas se ha utilizado ampliamente para inactivar genes o regiones reguladoras a través de la reparación mediada por la unión final no homóloga (NHEJ) de roturas de doble cadena (DSB) o para insertar / corregir mutaciones a través de la reparación dirigida por homología (HDR).
Mientras que el mecanismo de reparación de NHEJ se usa comúnmente en todas las células a lo largo del ciclo celular, HDR tiene lugar principalmente en las células en división. Además, las estrategias basadas en HDR son más complejas, ya que requieren el uso de una plantilla de donante (que contenga la edición deseada) entregada como oligo desoxinucleótidos monocatenario (ssOD) o utilizando un vector viral como el virus adenoasociado (AAV).
Actualmente se está realizando un gran esfuerzo para optimizar la eficiencia del HDR para generar modelos de enfermedades o corregir mutaciones genéticas. A modo de ejemplo, Simone et al. informar en este número del desarrollo de una plantilla ssODN de donante quimérico fusionada al tracrRNA que se entrega eficientemente al sitio objetivo, logrando así altas frecuencias HDR (ver página 40). Del mismo modo, Zhao et al. describir el uso de elementos genéticos bacterianos conocidos como retrones para producir continuamente en la celula una plantilla de donante de ADN fusionada con el ARN guía para lograr la edición del genoma mediada por HDR (ver página 31).
Por supuesto, el uso de CRISPR ha planteado una serie de preocupaciones de seguridad para aplicaciones clínicas (revisado por Boutin et al. en este número; ver página 19).. La actividad fuera del objetivo es una de esas preocupaciones. Sin embargo, debemos tener en cuenta que: (1) cada día, las células humanas adquieren naturalmente numerosas lesiones de ADN.1,2; y (2) en comparación con las estrategias de edición del genoma, los enfoques de adición de genes ampliamente utilizados se basan en la integración semialeatoria de vectores lentivirales portadores de genes exógenos y elementos cis-reguladores en el genoma, lo que potencialmente puede conducir a eventos genotóxicos difíciles de predecir.3
La generación de DSB por CRISPR-Cas también puede causar grandes reordenamientos genómicos (por ejemplo, en presencia de DSB concomitantes en sitios dentro y fuera del objetivo).4 Además, incluso la generación de un solo DSB puede conducir a aberraciones genómicas, como la pérdida cromosómica, la formación de micronúcleos y la cromotripsis.5 Sin embargo, las células con aberraciones cromosómicas a menudo son contraseleccionadas.4 Finalmente, otra preocupación en el campo de los enfoques terapéuticos basados en la edición del genoma es el riesgo asociado con el uso de AAV que pueden integrarse en puntos calientes oncogénicos.6 Es importante destacar que el uso de plantillas alternativas de donantes como las descritas en este número (véanse las páginas 31 y 40), así como el desarrollo de vehículos alternativos para CRISPR-Cas, como las nanopartículas,7 podría evitar el riesgo oncogénico potencial asociado a la integración de vectores virales.6
Vale la pena destacar las limitaciones de los ensayos preclínicos para evaluar eventos potencialmente genotóxicos. La sensibilidad de los ensayos actualmente en uso es relativamente baja, particularmente en células primarias (la población objetivo de los enfoques de edición del genoma). Esto podría ser una preocupación, especialmente cuando el enfoque terapéutico se basa en la modificación genética de millones de células. Se han logrado avances en este sentido, como lo informaron en este número Allen et al., quienes desarrollaron un método de imágenes de alto rendimiento basado en el flujo para detectar daños en el ADN en células progenitoras madre hematopoyéticas primarias tratadas con CRISPR-Cas (la población objetivo en los enfoques de terapia génica para trastornos genéticos hematopoyéticos y no hematopoyéticos; ver página 80).
Otro desafío es la variabilidad entre los individuos que podría conducir a una amplia diversidad en las ediciones fuera del objetivo, dependiendo del genotipo. La evaluación de la actividad fuera del objetivo para cada paciente potencial sería desafiante y engorrosa, pero los métodos novedosos, como el enriquecimiento y secuenciación de oligonucleótidos (ONE-seq), tienen en cuenta la variación de la secuencia genómica que existe dentro de la población humana, aunque este análisis hasta ahora se limita a objetivos fuera de la predicción in silico.8
Del mismo modo, los modelos preclínicos a menudo tienen varias limitaciones. Por ejemplo, los animales humanizados que llevan secuencias objetivo humanas se utilizan comúnmente para demostrar la eficacia in vivo de las estrategias de edición del genoma, a menudo en estudios a largo plazo. Sin embargo, no se pueden utilizar para evaluar la actividad fuera del objetivo y la persistencia de las ediciones fuera del objetivo in vivo. Por el contrario, el xenotrasplante de células humanas (por ejemplo, células madre/progenitoras hematopoyéticas) en ratones inmunodeficientes permite evaluar la eficacia y la seguridad in vivo en experimentos a largo plazo. Sin embargo, si estos modelos quiméricos son útiles para predecir los resultados clínicos en los pacientes sigue siendo un tema de debate.
Dada la introducción relativamente reciente de CRISPR-Cas con fines terapéuticos, todavía faltan guías establecidas para estudios preclínicos para cada enfermedad y población de pacientes. Sin embargo, se han realizado esfuerzos en esta dirección, por ejemplo, la creación del «grupo de trabajo de terapia genómica» que, entre diversas actividades, tiene como objetivo identificar los estudios preclínicos necesarios que se realizarán en los enfoques de terapia génica para la enfermedad de células falciformes. Es importante destacar que los próximos resultados de los estudios clínicos contribuirán a validar los estudios preclínicos actuales de eficacia y seguridad.
Se han iniciado ensayos clínicos basados en el uso de herramientas de edición del genoma para tratar enfermedades genéticas o no genéticas, y ya han mostrado resultados clínicos prometedores tempranos, especialmente en el ensayo patrocinado por CRISPR Therapeutics para las beta-hemoglobinopatías.9 En un estudio, se observaron translocaciones cromosómicas después de la edición multiplex CRISPR-Cas de linfocitos T para mejorar la inmunidad antitumoral, pero disminuyeron con el tiempo, lo que sugiere que estos eventos fueron contraseleccionados. Las células modificadas persistieron durante 9 meses sin la ocurrencia de transformación maligna.10 También se observó una anomalía cromosómica durante el ensayo clínico Allogene CAR-T.11 Sin embargo, eso no estaba relacionado con la edición del genoma de TALEN y no tenía importancia clínica.
Estos estudios muestran que es fundamental definir los posibles eventos genotóxicos causados por cada estrategia específica de edición del genoma y dominar las herramientas y definir criterios para identificar los eventos inducidos por la edición del genoma y distinguirlos de las aberraciones genómicas preexistentes. En particular, los ensayos clínicos actuales o futuros para las beta-hemoglobinopatías9 utilizar estrategias CRISPR-Cas que han demostrado causar la formación de micronúcleos y cromotripsis5 o pérdidas de heterocigosidad a escala de megabase.12 Hasta ahora, afortunadamente, no se ha reportado ningún evento adverso en pacientes tratados con estos enfoques. Se necesitan estudios de seguimiento a largo plazo para evaluar completamente la eficacia y la seguridad de los enfoques terapéuticos CRISPR-Cas y evaluar la relación riesgo/beneficio de estos tratamientos para cada enfermedad específica.
La frecuencia de eventos genotóxicos potencialmente inducidos por la nucleasa CRISPR-Cas puede reducirse sustancialmente o eliminarse mediante sistemas de edición de base y primos más recientes que pueden insertar/corregir mutaciones sin generar DSB. Sin embargo, estas tecnologías podrían plantear problemas de seguridad adicionales, como la actividad impredecible (independiente del ARN guía) fuera del objetivo de los editores de base, así como su edición de ARN fuera del objetivo. Se cree que la edición prime tiene una baja actividad fuera del objetivo, pero su eficiencia en las células primarias debe mejorarse para posibles aplicaciones terapéuticas. Una de esas posibles aplicaciones de la edición principal se describe en este número por Laval et al. (ver página 109).
También se deben implementar ensayos y modelos preclínicos confiables para aplicaciones basadas en el uso de estos novedosos sistemas de edición, ya que este campo se está moviendo rápidamente con Beam Therapeutics,13 que se está preparando para iniciar un ensayo clínico para pacientes con anemia de células falciformes.
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