Edición de genes CRISPR

Harrison P.

Introducción

En su Conferencia Nobel de 1959, Joshua Lederberg discute el mutágeno específico, un agente que podría «penetrar en un gen dado, reconocerlo y modificarlo de una manera específica», como el ignis fatuus de la genética, un objetivo potencialmente inalcanzable que uno se siente obligado a perseguir. Si bien varios contendientes surgieron a lo largo de los años, no fue hasta 2012 que Charpentier y Doudna realmente se dieron cuenta del objetivo de Lederberg con su descripción de una endonucleasa de ADN guiada por ARN fácilmente programable conocida como CRISPR Cas9 [1], que cuando se usó en combinación con una plantilla de donante de ADN, abrió el camino a una cura para enfermedades genéticas mediante la edición precisa del genoma [2]. En los últimos meses de la primera década de CRISPR, este editorial revisa el impacto de la tecnología CRISPR en la medicina respiratoria.

CRISPR en la clínica

Con todas las nuevas tecnologías, la primera pregunta es ¿cuánto tiempo falta para que llegue a la clínica? Bueno, en el caso de CRISPR, ya estamos allí en base a los datos de ensayos clínicos publicados recientemente para la amiloidosis por transtiretina (TTA), una enfermedad que afecta predominantemente al corazón y los nervios, con síntomas respiratorios, como dificultad para respirar. Dado que la TTA es causada por una acumulación de la proteína TTR mal plegada, se utilizó la estrategia de edición CRISPR más simple, el uso de un solo ARNz guía (ARNg) para dirigir a Cas9 a cortar e interrumpir el gen TTR, para ver si esto reduciría los niveles de proteína TTR circulante [3]. El ARNg y el ARNm que codifican Cas9 se envolvieron en nanopartículas lipídicas (LNP) recubiertas con proteína ApoE recombinante para dirigirse al hígado y se administraron por vía intravenosa. Los datos de tres pacientes a los 28 días después de la infusión mostraron una reducción del >80% en los niveles séricos de TTR, y los datos de seguridad iniciales no mostraron efectos adversos, aunque los autores reconocen que los participantes que se ofrezcan como voluntarios para recibir la terapia deberán someterse a un monitoreo de seguridad a largo plazo.

3. Efectos CRISPR fuera del objetivo

Una pregunta rutinaria sobre CRISPR es el potencial y las consecuencias de los efectos fuera del objetivo (OTE); ¿Qué sucede si el gRNA se dirige al Cas9 a un sitio objetivo con una secuencia similar pero no idéntica que crea una rotura de doble cadena (DSB) no deseada en una ubicación (s) indeseable en el genoma? Se ha realizado una gran cantidad de investigación para minimizar la incidencia de tales OTE, y como se muestra en el estudio clínico descrito anteriormente, no se detectó ninguno, sujeto a los límites de las técnicas utilizadas y los tejidos muestreados. Pero, ¿cuáles son las posibles consecuencias de una OTE? La posibilidad descrita más recientemente es que algunos Cas9 / gRNAs pueden causar bajos niveles de cromotripsis (literalmente, trituración de cromosomas) y la formación de micronúcleos [4], reforzando la importancia del cribado de los ARNG para evitar posibles OTA. De manera tranquilizadora, el estudio encontró que es poco probable que las células que no se dividen produzcan micronúcleos, por lo que es poco probable que otros ensayos clínicos en curso que utilizan Cas9 / gRNAs para atacar el trastorno de la retina LCA-10 (ensayo clínico NCT03872479) se vean afectados. Los autores también sugirieron que cuando se está considerando la edición ex vivo de las células en división, mantenerlas en un estado de reposo durante la edición podría reducir la incidencia de cromotripsis y la formación de micronúcleos. Pero quizás su sugerencia final sea la más pertinente; ¡Deberíamos centrarnos en desarrollar estrategias de edición que NO generen DSB!

4. CRISPR sin opción de corte 1 – edición base

La primera opción importante de CRISPR desarrollada para editar sin DSB fue la edición base, una de las varias tecnologías pioneras por el laboratorio de David Liu [5]. Ya utilizados en una serie de estudios preclínicos, han surgido dos ejemplos recientes de edición de bases para la enfermedad pulmonar. El primero aborda el síndrome STAT3-hyper IgE, una inmunodeficiencia primaria negativa dominante que resulta en IgE sérica alta e infecciones pulmonares [6]. El estado negativo dominante de esta enfermedad significa que la terapia de adición génica basada en ADNc no es adecuada, pero dos de las mutaciones causantes de enfermedades más comunes podrían revertirse mediante la edición de la base de adenina (ver Recuadro 1). En este estudio, mostraron cómo uno de ellos, c.1145G>A / p.R382Q, podría corregirse de manera eficiente para los fibroblastos primarios. El siguiente paso sería evaluar in vivo con un modelo animal apropiado, o posiblemente probarlo en sistemas organoides humanos derivados de células iPS de pacientes.

Recuadro 1. La edición de base de adenina (ABE) se puede dirigir a cualquiera de las hebras [7]. Izquierda – C > mutación T en la hebra superior causa enfermedad, ABE de A a G en la hebra inferior puede convertirse potencialmente en WT. Derecha – G > Una mutación en la hebra superior causa enfermedad, ABE de A a G en la hebra superior puede convertirse potencialmente en WT.

Pantalla de tamaño completo

En un segundo estudio, el progreso con la edición base es más avanzado. Una gran proporción de personas con enfermedad de células falciformes (SCD) sufren una enfermedad respiratoria significativa. La SCD está causada por la mutación c.20A>T/p.Glu6Val en ambos alelos del gen HBB (HBB^S/S). Como se muestra en el recuadro 2, no es posible (en la actualidad) corregir completamente esta mutación mediante la edición de base, pero la edición de base de adenina podría convertir la A en la hebra inferior a G, que modifica el codón 6 a GCG que codifica alanina (en lugar del glutamato de tipo salvaje). La alanina en el codón 6 da como resultado la formación de HBB^G que es una variante no patógena conocida como Makassar. En un estudio reciente [7], células progenitoras madre hemopoyéticas CD34+ humanas (HSPC) de un HBB^S/S Los donantes fueron editados con ARNm que codifica un editor de base de adenina y el ARNg apropiado. Veinticuatro horas después, las células fueron trasplantadas a ratones NBSGW que apoyan el injerto de HPSC humanos. Cuatro meses después, casi el 60% de la globina similar a β se β^S, y los glóbulos rojos derivados de HPSC editado mostraron una reducción de cinco veces en la anemia falciforme en comparación con los controles no editados. Dada la promesa mostrada en un ensayo clínico de una estrategia de edición de genes CRISPR ex vivo diseñada para regular al alza la hemoglobina fetal y la gammaglobulina, que resultó en que el primer receptor fuera independiente de la transfusión y libre de episodios vaso-oclusivos un año después [8], una ruta ex vivo similar podría utilizarse potencialmente para evaluar esta estrategia de edición de base CRISPR.

Recuadro 2. La mutación A > T en la hebra superior causa la enfermedad de células falciformes (HBB^S). ABE de A a G en la hebra inferior no se puede convertir a HBB^WT, pero potencialmente puede convertir a Makassar (HBB^G) y mejorar la gravedad de la enfermedad convirtiendo el codón Val en Ala.

Pantalla de tamaño completo

5. CRISPR sin opción de corte 2 – edición epigenética

Una segunda forma de evitar roturas de doble cadena y potencialmente tratar la enfermedad es la edición epigenética. Esto implica el uso de CRISPR para dirigirse a los reguladores transcripcionales en regiones precisas del genoma con el fin de modificar la expresión génica. Un interrogatorio de 18 regiones reguladoras potenciales del gen CFTR con 133 gRNAs diferentes y el dCas9^p300 El activador transcripcional identificó una única guía, gRNA40, que dio un aumento moderado en los niveles de ARNm CFTR en células de tipo silvestre [9]. Cuando se prueba en células homocigotas para la mutación más común que causa la FQ, F508del, el dCas9^p300/gRNA40 resultó en un aumento mucho mayor en el ARNm CFTR F508del. Si bien este aumento en el ARNm solo no tuvo un aumento significativo en la actividad del canal iónico CFTR F508del, se observó una interacción sinérgica con el fármaco modulador de la FQ, VX809, casi duplicando la actividad de corriente de cortocircuito del canal iónico CFTR F508del en relación con el tratamiento con VX809 solo. Será interesante ver si dCas9^p300/gRNA40 puede regular al alza la expresión de ARNm de las otras variantes de FQ, particularmente detener las variantes de codón (PTC) donde el ARNm CFTR está desestabilizado, y ver si esto conduce a interacciones sinérgicas con los fármacos de lectura de PTC en desarrollo. Sin embargo, un desafío potencial en el desarrollo de este enfoque para la aplicación terapéutica es que la expresión a largo plazo, o la dosis repetida, de la dCas9^p300 y se requeriría ARNg.

6. CRISPR y cáncer de pulmón

El clásico, pero relativamente simple, KP^GEMM El modelo de ratón de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) se realiza cruzando dos cepas de ratón para generar una mutación activadora condicional de KRas y desencadenar la deleción de Trp53. El uso de este sistema como base para modelar perfiles de cáncer más complejos lleva mucho tiempo y requiere muchos animales. Un estudio reciente [10] describe dos aplicaciones de CRISPR para desarrollar modelos que representen más de cerca el perfil genético de la enfermedad humana, y reducir, refinar o reemplazar (3R) el número de animales requeridos. Primero, demostraron que KP^GEMM los ratones creados con CRISPR eran indistinguibles del KP clásico^GEMM animales. Luego, utilizaron CRISPR para instalar una variedad de mutaciones específicas adicionales en este fondo, y observaron diferentes perfiles de supervivencia dependiendo de las mutaciones agregadas. Su segunda estrategia consistió en el uso de vectores de virus adenoasociados (AAV) portadores de Cas9, gRNAs y plantillas de edición para introducir variantes en los pulmones de ratones en una variedad de fondos diferentes en 12 semanas, experimentos que tomarían 12 meses según métodos convencionales. Debería ser posible utilizar los mismos vectores AAV para instalar las mismas ediciones en organoides humanos y potencialmente reemplazar algunos modelos in vivo.

En un modelo animal grande para estudiar el cáncer de pulmón, se han desarrollado mini-cerdos CRISPR de tal manera que Cas9 solo se expresa cuando las células se transducen con un vector AAV específico, que también codifica múltiples gRNAs / plantillas de donantes para dirigirse simultáneamente a genes específicos de interés [11]. En este modelo, se observaron aumentos modestos en las tasas de proliferación celular cuando STK1 / TP53 fueron eliminados e instalados los KRAS G12D. Sin embargo, se observó un aumento mucho mayor en las tasas de proliferación cuando se apuntó a PTEN en lugar de STK1. Similar al modelo de ratón, el hecho de que se pueda lograr la edición de múltiples objetivos con un solo vector AAV permite evaluar perfiles genéticos complejos de forma rápida y sencilla, y con muchos menos animales de lo que era posible anteriormente.

7. CRISPR y Covid

CRISPR Cas9 no se puede usar para atacar el SARS-CoV2 directamente ya que Cas9 es una nucleasa de ADN y el virus tiene un genoma de ARN. Sin embargo, Cas9 se ha utilizado para identificar los factores celulares en los que se basa este parásito intracelular obligado para su replicación. Dos estudios recientes [12,13] describió el uso de bibliotecas de ARNg Cas9 para eliminar genes celulares en líneas celulares humanas y luego seleccionar células resistentes a virus. Utilizando este enfoque de detección imparcial, ambos grupos extrajeron genes celulares conocidos importantes para la replicación del SARS-CoV2, como ACE2 y CTSL, además de un grupo común de otros genes que constituyen objetivos potenciales para la terapia antiviral.

Para atacar directamente al SARS-CoV2, un panel de gRNAs dirigidos a cinco regiones conservadas de su genoma de ARN fueron examinados con la endonucleasa de ARN dirigida por ARN, Cas13a [14]. Utilizando el ARNg más efectivo identificado a partir de una prueba de detección in vitro, el tratamiento con Cas13a resultó en una reducción del 57% en el número de copias del SARS-CoV-2 en un modelo de hámster de infección por virus, y una prevención estadísticamente significativa de la reducción del peso corporal, proporcionando una prueba de concepto de que esta estrategia CRISPR podría alterar la patogénesis del SARS-CoV-2.

8. Entrega CRISPR

La evaluación clínica de CRISPR requerirá sistemas de administración robustos, pero hay una serie de opciones, que se han evaluado con éxito in vivo para los sistemas de edición, incluidas las nanopartículas capaces de dirigir el ARNm a órganos específicos [15] o partículas cargadas de ADN que penetran en el moco [16]. Paralelamente, tanto un número de virus adeno-asociados [17] y Adenovirus dependiente del ayudante [18] también se ha demostrado que los vectores son efectivos para editar los pulmones de modelos animales. Las partículas artificiales similares a virus que se pueden usar para la edición in vivo también pueden ofrecer opciones terapéuticas adicionales [19].

9. Opinión de expertos

La edición CRISPR ofrece numerosas opciones para el futuro de la medicina respiratoria para la enfermedad pulmonar hereditaria y adquirida. El primer desafío será examinar el creciente número de herramientas CRISPR y métodos de entrega que están surgiendo para identificar las estrategias más susceptibles de desarrollo clínico, una tarea no pequeña teniendo en cuenta que una nueva publicación crispr aparece en PubMed cada 60 minutos. A medida que miramos hacia el futuro, el mandato se extiende más allá de los esfuerzos científicos y clínicos para desarrollar tratamientos para enfermedades respiratorias, posiblemente a través de consorcios internacionales, pero también requiere que estos desarrollos se traduzcan en tratamientos éticos, asequibles y accesibles para todos.