Estrategias emergentes de células T con CAR para el tratamiento de la LMA

Este posteo establece la oportunidad de tratamiento de los CART T en la Leucemia Mieloide Aguda.

Vishwasrao, Paresh et al. “Emerging CAR T Cell Strategies for the Treatment of AML.” Cancers vol. 14,5 1241. 27 Feb. 2022, doi:10.3390/cancers14051241

Las inmunoterapias adoptivas, que han demostrado ser prometedoras en el tratamiento de neoplasias hematológicas malignas, pueden dirigirse a la leucemia mieloide aguda (LMA) a través de vías distintas y complementarias. La inmunoterapia adoptiva de células T puede ser particularmente potente debido a la longevidad y la fuerte actividad citotóxica de las células T transferidas.

Una de estas inmunoterapias adoptivas son los receptores de antígenos quiméricos (CAR), que son receptores de antígenos recombinantes de una sola molécula que pueden redirigir la especificidad de las células T y mejorar la potencia antitumoral.

Estos receptores híbridos sintéticos están compuestos por una molécula de ligando de superficie celular fusionada con dominios de señalización ensamblados para redirigir la función de las células T.

La molécula de ligando extracelular puede derivarse de un fragmento variable de cadena única (scFv) derivado de un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígenos (Fab).

Esta modificación genética proporciona a una célula T una especificidad de antígeno alternativa. Al unirse a un antígeno específico, el CAR inicia la señalización y la activación de la célula T que conduce a la muerte de células objetivo. Muchos tumores regulan a la baja la expresión del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) para evitar los efectos antitumorales de las células T.

Esta resistencia se evita debido a la naturaleza funcional del modo de acción independiente de MHC de las células CAR-T.

Los dominios intracelulares CAR pueden incorporar tanto la señalización del receptor de células T por CD3ζ como las señales coestimuladoras como CD28 y / o 4-1BB, que han demostrado ser particularmente efectivas para promover simultáneamente la supervivencia de las células T y la matanza efectiva del objetivo.

Actualmente, hay cinco terapias de células CAR-T aprobadas por la FDA: Tisagenlecleuel [1,2] (KYMRIAH; Novartis), Axicabtagene ciloleucel [3,4] (YESCARTA, Kite Pharma, Gilead Science), Brexucabtagene autoleucel (TECARTUS; Kite Pharma), l Isocabtagene maraleucel (BREYANZI; Juno Therapeutics, Inc., una compañía de Bristol-Myers Squibb) e Idecabtagene vicleucel (ABECMA; Celgene Corporation, una compañía de Bristol-Myers Squibb). La mayoría de las terapias aprobadas con células CAR-T se dirigen a CD19, un antígeno específico de células B que ha mostrado resultados tremendos en los ensayos clínicos contra la leucemia linfoblástica aguda (LLA) y el linfoma no Hodgkin [5]. El 83% de las personas tratadas con el primer fármaco CAR-T aprobado, «Kymriah» de Novartis, lograron la remisión completa en 3 meses. Los potenciales terapéuticos de las células T de transferencia adoptiva que expresan CAR han demostrado éxito clínico contra las neoplasias malignas avanzadas de células B [6,7] y la leucemia recidivante y refractaria (r/r) [6,8]. El desarrollo de CAR no se ha limitado al cáncer hematológico, sino que se está expandiendo ampliamente a tumores sólidos [9].

En la última década, se descubrió que los CAR de segunda generación dirigidos a CD19 eran la terapia de células T adoptiva más eficaz hasta la fecha. En comparación con la primera generación, los CAR de segunda generación dotaron un mayor potencial de respuestas antitumorales y duraderas en el linfoma de células B de alto grado en adultos [10,11,12] y en la leucemia linfoblástica aguda de células B (LLA-B) tanto en niños como en adultos que son refractarios a todas las terapias estándar [13,14,15,16 ]. En general, las neoplasias hematológicas malignas relacionadas con las células B se dirigieron inicialmente con CD19 y CD20, que se expresan diferencialmente en los linfocitos de células B. La implementación de CD19-CAR para atacar la leucemia se desarrolló inicialmente a partir de estudios preclínicos publicados después de la sucesión inmediata por varios grupos (Micheal Sadelain, Steven Rosenberg, Stephen J. Forman y Carl June). Entre todos los CAR-T, la terapia con células CAR-T CD19 para la leucemia linfoblástica aguda (LLA) ha mostrado los resultados más prometedores (>85%) ya que los CAR-T que responden al marcador de células pan-B CD19 han demostrado una eficiencia robusta. Aunque la citotoxicidad antitumoral se dirigió a las células B malignas que expresan CD19, también se dirigieron a las células B sanas normales. La toxicidad fuera del tumor condujo a la aplasia de células B, una afección que se maneja clínicamente con la infusión profiláctica de γ-globulina [17]. La adición de los dominios coestimuladores CD28 y 4-1BB (CAR de segunda generación) al diseño car no solo elevó significativamente la actividad antitumoral, sino que prolongó la eficiencia de supervivencia in vivo de las células CAR-T. Hubo accesibilidad sin obstáculos del antígeno diana en las células tumorales circulantes, sin ningún factor inmunosupresor importante, como CD95/FasL y citoquinas como la interleucina (IL)-10 y el factor de crecimiento transformador (TGF-β). Todas estas condiciones juntas hicieron de CD19 un candidato más adecuado para la terapia de células CAR-T, sin embargo, los resultados clínicos informaron algunas desventajas durante los ensayos clínicos. La nueva evidencia emergente ha identificado obstáculos tecnológicos y biológicos críticos. Una preocupación importante es la falta de células T del paciente, que se requieren para producir las células CAR-T. Con estos desafíos, los científicos se están orientando hacia la simplificación de la viabilidad y la logística de la generación de células CAR-T con el concepto de «células CAR-T universales», que funcionarían como células CAR-T «listas para usar» [18]. Esta revisión profundiza en la comprensión actual de la biología detrás del diseño, señalización, expresión y funcionalidad de CAR, y los diseños experimentales de CAR dirigidos a AML.

3.1. Terapia CAR anti-FRβ específica para la LMA

Powell et al. han informado previamente que la familia de proteínas del receptor de folato (FR) es útil en la inmunoterapia de células T. FRα y FRβ son proteínas unidas a la superficie celular a través de enlaces glicosil-fosfatidilinositol (GPI) [46] que comparten casi el 70% de homología y un mecanismo común de absorción de folato mediado por endocitosis del receptor. Sin embargo, FRα y FRβ se expresan diferencialmente en varios tejidos, siendo uno específico de la célula epitelial, mientras que el otro se expresa en las células hematopoyéticas de linaje mieloide, respectivamente. Ambos receptores están regulados al alza en un entorno maligno [47]. FRβ se expresa en el 70% de los tumores primarios de LMA, por lo que es un objetivo atractivo para la inmunoterapia de células CAR-T. Curiosamente, la expresión de FRβ está regulada al alza en los blastos de AML cuando se trata con ácido retinoico all-trans (ATRA), un medicamento que ya está aprobado por la FDA para la subclase M3 AML [48]. Las células CAR-T dirigidas por FRα ya se encuentran en un ensayo de fase I sobre inmunoterapia adoptiva utilizando células T modificadas genéticamente para el cáncer de ovario [49]. La adición de señalización coestimuladora a través de CD137 (4 1-BB) condujo a una mayor actividad antitumoral de las células T diseñadas con CAR a través de la persistencia in vivo y la localización del tumor [50]. Lynn et al. han generado y caracterizado construcciones CAR humanas específicas de FRβ (m909) que contienen el m909scFv, que reconoce FRβ humano [10]. La validación de los CAR específicos de FRβ se produjo a través de datos iniciales en los que las células diseñadas con C30-FRβ confirmaron la orientación de FRβ. La plataforma m909 CAR permite una focalización eficiente y específica, demostrada por ensayos de cultivo in vivo y que resulta en la producción de citoquinas, la regulación ascendente del marcador de activación, la proliferación y la lisis celular objetivo cuando los niveles de antígeno son altos. En presencia de células humanas de LMA que expresan FRβ, las células m909-CAR-T mantuvieron una activación específica en presencia de antígeno. La activación de CAR es directamente proporcional a la expresión de FRβ. Con la disminución de la expresión de FRβ, la actividad de CAR disminuyó, como lo demuestra la reducción de la producción de IFNγ y citólisis. Esta es una preocupación con el potencial de crecimiento de clones leucémicos bajos en FRβ en la terapia basada en CAR m909. Sin embargo, la regulación al alza específica de ATRA de la expresión de FRβ en células de LMA FRβ + y la coculturación de células CAR-T m909 con LMA pretratada con ATRA-pretratada exhibieron una mayor producción de IFNγ y actividad citolítica. Se sabe que ATRA induce la diferenciación de THP1 y HL60, medida por una mayor producción de citoquinas y expresión de moléculas coestimuladoras [11,12]. ATRA no afectó la expresión de FRβ en HSC o monocitos sanos. Esto sugiere que la inducción de FRβ mediada por ATRA en la LMA podría aplicarse sin aumentar la capacidad de reconocimiento de tejidos sanos por las células CAR-T m909. En comparación con ATRA solo, se ha demostrado que el tratamiento dual con inhibidores de la histona desacetilasa (HDAC) estimula aún más la expresión de FRβ en la LMA in vitro [13]. Con estos datos, una combinación optimizada de ATRA y agentes inductores de FRβ podría presentar una oportunidad para un aumento adicional de la eficacia de las células CAR-T m909. La expresión de FRβ también se encuentra en las células normales de linaje mieloide y puede ser inducida en la activación de macrófagos. Este sigue siendo un objetivo potencial para la toxicidad fuera del tumor en el objetivo por las células CAR-T específicas de FRβ porque las células CAR-T m909 no han mostrado ninguna lisis de monocitos de sangre periférica de donantes sanos.

3.2. Terapia anti-CD33 CAR para la LMA

Casi el 90% de las células leucémicas en pacientes con LMA se expresaron CD33 en células mieloides [14,15]. CD33 es un receptor de unión al ácido siálico específico mieloide expresado en la mayoría de los blastocitos de LMA y células madre leucémicas en pacientes, que fue validado como un objetivo efectivo en ensayos clínicos [16]. La generación e implementación de anticuerpos monoclonales en ensayos preclínicos y clínicos han mostrado resultados variables. Lintuzumab es un anticuerpo monoclonal humanizado específico de CD33 [17,51] que ha demostrado ser prometedor en las fases preclínicas y tempranas de los ensayos clínicos. Sin embargo, no hubo una mejoría significativa en la tasa de respuesta o la supervivencia en comparación con la quimioterapia estándar en ensayos posteriores [52,53]. Ensayos clínicos con CD33 diseñado (01690624 NCT) y varias proteínas recombinantes derivadas de anticuerpos dirigidas a CD33 se encuentran en desarrollo preclínico avanzado, incluidos los diacuerpos biespecíficos CD16-CD33 [54], el agente BiTE CD33-CD3 [55,56], AMG330 y el CD33-CD16-CD123 de triple cuerpo de doble orientación, SPM2. Otro anticuerpo monoclonal anti-CD33 humanizado, Gemtuzumab Ozogamicina, es un fármaco conjugado de anticuerpos vinculado a la caliqueamicina que fue validado como tratamiento de la LMA mediante una mayor eficacia clínica en un ensayo clínico de Fase II. Los pacientes con LMA CD33+ que recayeron después del tratamiento con gemtuzumab ozogamicina generalmente recayeron debido a la pérdida de antígeno, lo que indica un modo común de resistencia [57]. Algunos grupos han demostrado actividad antileucémica in vitro contra CD33, pero Wei-dong Han et al. fueron los primeros en informar el uso clínico para el tratamiento en pacientes con LMA refractaria a la quimioterapia. Este ensayo demostró la viabilidad y eficacia de las células CAR-T autólogas, que fueron redirigidas a CD33 (CART-33). Además, Kendrian et al. [58] también diseñaron células CAR-T (CART-33) utilizando scFv anti-CD33 que se utilizó en gemtuzumab ozogamicina (clon My96). Los resultados han demostrado funciones efectoras significativas in vitro, así como la erradicación de la leucemia y la supervivencia prolongada de los xenoinjertos de LMA. CART33 ha dado lugar a citopenias y una reducción de los progenitores mieloides en modelos de xenoinjerto de toxicidad hematopoyética [58]. Con resultados alentadores del trabajo preclínico de CART33, el grupo de Brentjens dio un paso más para combinar diferentes elementos, como cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo M-195 humanizado, dominios de señalización CD28-CD3ζ, el gen IL-12 y el receptor truncado del factor de crecimiento epidérmico (EGFRt) [59]. Con esto, la transducción del vector retroviral de construcciones CAR tri-cistrónicas (EGFTr/HuM195-28z/IL-12) en dos modelos preclínicos diferentes de ratón ha mostrado una reducción en la enfermedad CD33+ periférica, lo que indica que se requeriría una validación adicional para su utilización clínica. Un nuevo CAR anti-CD33 de segunda generación que incorporó una cola de señalización 4-1BB-CD3ζ ha demostrado previamente ser eficaz en ensayos clínicos de leucemia mieloide crónica y aguda [60,61,62]. Los CAR anti-CD33 han demostrado ser altamente efectivos, incluso en proporciones muy bajas de efector a objetivo (E: T) con una muerte robusta tanto de tumores primarios como de líneas celulares tumorales en proporciones de E: T tan bajas como <1 células efectoras por 20 objetivos. Este CAR soporta un alto nivel de procesividad de células T con una sola célula que mata en serie múltiples células tumorales. Como es típico con la LMA temprana y refractaria, esta característica sería significativa cuando la carga tumoral es alta. Se demostró una alta sensibilidad al ligando de la célula CAR-T anti-CD33 con una fuerte citólisis específica que fue independiente del nivel de expresión de CD33 con líneas celulares de LMA y muestras primarias de LMA. Las células CAR-T anti-CD33 se probaron en un modelo de prevención in vivo donde mostraron resultados sorprendentes con la prevención del crecimiento tumoral en la LMA establecida. En un modelo de tratamiento, la supervivencia se prolongó significativamente, aunque los tumores finalmente avanzaron en todos los ratones. Con un tratamiento avanzado, se pueden necesitar dosis múltiples de células CAR-T cuando hay una enfermedad extensa para erradicar la mayor carga de células tumorales [58].

3.3. Terapia anti-CD123 CAR para la LMA

La búsqueda de los objetivos óptimos y deseables para la AML sigue siendo enigmática. Junto con otros marcadores mieloides altamente expresados en las células blásticas, CD123 se exploró como un objetivo potencial. CD123 es la subunidad alfa del receptor de interleucina-3 (IL-3). Estructuralmente, es una proteína de membrana de un solo paso tipo I que contiene tres dominios extracelulares, uno transmembrana y uno intracelular. CD123 se expresa en una gama pleiotrópica de células inmunes, que incluyen monocitos, células B, megacariocitos, células dendríticas plasmocitoides y HSPC [63]. Los estudios que utilizaron modelos preclínicos para validar la orientación CAR-T de CD123 corroboraron hallazgos anteriores utilizando la orientación basada en anticuerpos de CD123 [64], donde no hubo toxicidad hematopoyética significativa después de usar el modelo preclínico para validar la orientación CAR-T de CD123 [61,65]. Científicos de City of Hope y Mardiros et al., han demostrado experimentos in vivo con una mejor supervivencia pero sin efectos a largo plazo que podrían atribuirse al vector retroviral utilizado junto con la coestimulación CD28 [65]. Gill et al. también observaron que dirigirse a CD123 a través de células T diseñadas con CAR podría resultar en el rechazo de la LMA humana y la mieloablación en modelos de ratones inmunodeficientes. Las células CAR-T con 4-1BB coestimulado fueron capaces de rechazar la LMA humana primaria injertada in vivo, pero indicaron deterioro en la hematopoyesis en un modelo de xenoinjerto [66]. Los estudios primarios de xenoinjerto de LMA (PDX) derivados del paciente que se dirigieron a CART123 mostraron efectos casi similares, como la lisis tumoral y el síndrome de liberación de citoquinas (CRS), que se informaron en pacientes con leucemia de células B tratados con células CART19 [61]. Curiosamente, CART123 incluso eliminó CD123mortecino leucemia (UPN034) y resultó en el establecimiento de un grupo de memoria de células T que era capaz de rechazar la enfermedad con una cinética de expansión mejorada. En el caso de CART33 o CART12, Gill et al. también observaron experimentalmente que no solo hubo una reducción significativa en los progenitores mieloides (CD34 + CD38 +) sino una pérdida de células madre hematopoyéticas (CD34 + CD38-) en dos modelos de ratón humanizados diferentes, también conocido como el sistema inmune humanizado (HIS) [67]. Se ha demostrado que el 70% de los blastocitos de LMA expresan tanto CD33 como CD123, lo que respalda la justificación de la orientación combinatoria de CD33 y CD123 en los tratamientos de LMA [16]. Sobre la base de la evidencia preclínica, se han iniciado varios ensayos clínicos para atacar múltiples antígenos [17,51,52,53]. Existe una fuerte evidencia preclínica de células CAR-T que se dirigen a los antígenos CD123 y CD33 [54,55,56,57]. Sin embargo, una preocupación importante en el desarrollo de terapias CAR derivadas de AML es el potencial de agotamiento de la médula ósea sana y las células progenitoras [54,57,58,59]. Estos antígenos se eligieron porque se ha demostrado repetidamente que exhiben una expresión elevada en los blastos de LMA en comparación con las células madre hematopoyéticas (HSC) normales, lo que indica un beneficio esencial con un impacto mínimo en la mielopoyesis normal. Los CAR biespecíficos creados por la producción de novo de fragmentos variables de cadena única CD33 y CD123 (scFvs) con señales CAR divididas («AND gated») exhibieron una proliferación óptima, producción de citoquinas, citotoxicidad reducida y toxicidad por HSC in vitro e in vivo (datos no publicados) Figura 2J).

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Figura 2

Modificaciones de las células CAR-T: (A) Estrategias de puerta lógica: Una molécula CAR para la activación y una segunda molécula CAR para la coestimulación en la misma célula T: el reconocimiento combinatorio de antígenos está optimizado para reducir la toxicidad «on-target/off-tumor». (B) Circuito de puerta SynNotch «AND»: Primero el receptor sintético Notch identificará el antígeno objetivo A, luego el dominio citoplasmático terminal en el lado proximal del «factor de transcripción» synNotch-CAR se escindirá y entrará en el núcleo y finalmente inducirá la expresión de CAR. El segundo receptor CAR se unirá al antígeno B para completar el circuito. (C) Interruptor «ON»: En presencia de una molécula pequeña, se pueden volver a ensamblar dos partes del CAR, en la construcción dividida, activando así las células CAR-T. La estrategia de diseño de una puerta lógica «AND» requiere tanto «antígeno + molécula pequeña» para la activación de células T. (D) Interruptor «OFF»: Células CAR-T armadas con «interruptor OFF»: se requiere el gen suicida (iCasp9) para activar secuencialmente el interruptor de apagado por el mecanismo de apoptosis. iCasp9 se coexpresa con la molécula CAR en las células CAR-T. La adición de una molécula pequeña, AP20187 (CID: inductor químico), conduce a la dimerización de iCasp3, que desencadena Casp3 aguas abajo para inducir apoptosis. (E) SUPRA CAR: Un zipFv tiene un scFv vinculado a una cremallera de leucina (Zip-A). Un zipCAR tiene una cremallera de leucina cognada (Zip-B) que puede unirse al Zip-A. La unión de A y B conduce a la activación de las células T. SUPRA-CAR actúa como un CAR universal. La afinidad entre las cremalleras A y B-leucina se ajusta para que se pueda controlar la intensidad y la actividad de señalización. La unión de Zip-A a un antígeno nulo abrogará la cascada de señalización y, por lo tanto, hará que las células T estén en un estado inactivo. (F) UniCAR CAR: Plataforma universal CAR-T (UniCAR) que se puede encender y apagar rápidamente con un interruptor que consta de dos componentes. En primer lugar, la CAR no reconoce directamente los antígenos tumorales y, por lo tanto, está inactiva. El segundo componente es un módulo de orientación (TM), un adaptador soluble que comprende un motivo reconocido por el receptor de UniCAR y una fracción de unión a antígenos altamente flexible dirigida contra un antígeno canceroso. (G) Plataforma RevCAR: Compuesta por epítopo peptídico extracelular E5B9 o E7B6 y CD28, dominio bisagra (HiD), dominio transmembrana CD28 (TMD), dominio coestimulatorio CD28 intracelular (CSD) y dominio de señalización activadora CD3ζ (ASD). Las células REVCAR-E5B9-28/3z o RevCAR-E7B6-28/3z CAR-T se redirigen hacia CD33 o CD123 expresadas en explosiones AML a través de módulos de destino de adaptadores, denominados «RevTM». Los RevTM son anticuerpos biespecíficos (bsAbs) que consisten en dos fragmentos variables de cadena única (scFvs) diferentes que se unen en un brazo a E5B9 o E7B6 del RevCAR y en el otro brazo a CD33 o CD123 en la superficie de los blastos de AML. (H) Plataforma STOP-CAR: La cadena S está compuesta por un c-Myc y DAP10, un dominio transmembrana, un dominio coestimulador, Bcl-XL y CD3ζ. La cadena R está compuesta por un scFv, un dominio transmembrana, un dominio coestimulador y la apolipoproteína humana E4 (apo4). Cuando el fármaco disruptivo no se administra, la cadena R y S puede unirse entre sí, y el CAR se puede activar en el compromiso del antígeno objetivo. Después de la administración disruptiva del fármaco, se asegura a su sitio de unión en el dominio Bcl-XL ubicado en la cadena S. Debido a esto, hace que la capacidad de la cadena R y S se empareje y el CAR se vuelve inactivable. (I) Prueba de concepto para células T CAR CD93 NO marcadas que pueden mitigar la toxicidad de las células endoteliales (J) Las nuevas células T CAR HUMANAs biespecíficas CD33/123 con dominios de coestimulación «AND gate» de señalización dividida fueron altamente eficaces in vitro para matar células diana, proliferar y generar una cantidad sustancial de citoquinas (datos no publicados) [68].

3.4. Terapia anti-CLL-1 CAR para la LMA

Se observó la expresión de una nueva molécula humana similar a la lectina tipo C-1 (CLL-1) en la mayoría de los blastos de LMA [69,70]. La LLC-1 está restringida al linaje hematopoyético, en particular a las células mieloides presentes en la sangre periférica y la médula ósea, pero en su mayoría ausentes en las células madre no comprometidas (CD34 + CD38 − o CD34 + CD33 −) mientras que está presente en subconjuntos de células progenitoras (CD34 + CD38 + o CD34 + CD33 +) [70]. La función de esta glicoproteína transmembrana tipo II se ha identificado como receptores inhibitorios, cuyos ligandos aún no se conocen. Una de las principales ventajas de la CLL-1 es la falta de expresión en otros tejidos sistémicos /normales. Jinghua Wang et al. generaron un CAR utilizando un sistema vectorial de tercera generación con una combinación de dominios coestimuladores CD28 y 4-1BB contra CLL-1 (células CART CLL-1) [71]. La observación preclínica dirigida a las células CLL-1CART en muestras primarias de pacientes con LMA indicó la eliminación de las células que expresan CLL-1 inoculadas en un modelo de ratón xenoinjertado. El co-cultivo de células CART CLL-1 generadas a partir de donantes sanos normales con HSC autólogas normales enriquecidas a partir de células de la médula ósea o PBMC condujo a la eliminación efectiva de las células progenitoras de CLL + y los granulocitos maduros después de 24 h. Aunque la eliminación se indicó en varios grados, es importante tener en cuenta que las células CAR-T CLL-1 salvaron a las HSC. A diferencia de CD123 y CD33, que se comparten entre la explosión de AML y las HSC normales, CLL-1 no se expresa en cd34 + CD38 − HSC y se puede usar potencialmente como antígeno objetivo. Wang et al. demostraron así que las células CAR-T CLL-1 son una terapia segura con alto potencial para el tratamiento de la LMA. En líneas similares, Tashiro et al. describieron el desarrollo y la evaluación de las células T receptoras de antígeno quimérico específicas de CLL-1 (CLL-1. CAR-Ts) y demostró además su actividad específica contra líneas celulares de LMA CLL-1 +, así como muestras de pacientes con LMA primaria in vitro. En comparación con las células T de control, CCL-1. Car-Ts redujo selectivamente la formación de colonias leucémicas en células mononucleares de sangre periférica de pacientes con LMA primaria. En un modelo de ratón de xenoinjerto humano, CLL-1. Los CAR-T mediaron la actividad antileucémica contra la LMA diseminada y prolongaron significativamente la supervivencia. Para hacerlo más efectivo con un enfoque sistémico, Tashiro et al. introdujeron el sistema de genes suicidas caspasa-9 para obtener el control sobre la CLL1. CART se dirige así como a reducir la muerte no deseada de las células mieloides normales maduras [72]. Un inconveniente importante de apuntar a la CLL-1 es que este antígeno también se expresa de manera variable en las células mieloides maduras. Sin embargo, las células progenitoras normales no son el objetivo de CLL-1. Car-Ts, y la disminución o eliminación activa de esta población efectora después de la terapia deben permitir la regeneración de células mieloides maduras.

3.5. Terapia anti-h8F4-CAR-T para la LMA

Junto con CD123 y CD33, hay una extensa búsqueda de otros candidatos que podrían usarse para la inmunoterapia de células CAR-T para atacar la LMA. En pacientes con LMA, el péptido PR1, derivado de los antígenos asociados a la leucemia proteinasa 3 y elastasa de neutrófilos, se sobreexpresa en HLA-A2. En estudios anteriores, Molldrem et al. utilizaron linfocitos T citotóxicos (CTL) citotóxicos específicos por péptidos inducidos por PR1 en individuos normales con HLA-A2+. Estas CTL mostraron citotoxicidad restringida por HLA hacia las leucemias mieloides [73]. Además, se identificaron células T citotóxicas específicas de PR1 en la sangre periférica de pacientes con leucemia mieloide, mediando la citotoxicidad contra los blastos leucémicos in vitro. En un modelo de ratón xenoinjerto de LMA, los investigadores informaron una reducción en la carga leucémica [74]. Las CTL específicas de PR-1 también se asociaron con un efecto de injerto contra leucemia (GVL) [73] después del trasplante alogénico de células madre (alo-SCT) [74,75]. Sergeeva et al. reportaron el desarrollo de una IgG2a murina similar a TCR mAb, m84, que se une a PR1/HLA-A2+ AML, mediando la lisis de la AML in vivo, que agotó con éxito la AML in vitro [76,77]. Algunos estudios han demostrado que una versión humanizada de ratón 8F4 humano IgG1 8F4-h8F4 retiene la actividad antitumoral contra la LMA con especificidad hacia PR1/HLA-A2 [77]. El uso de linfocitos de sangre de cordón umbilical (CB) ha sido una opción ideal, ya que son células T naïve [78], ya que el trasplante de CB (CBT) se realizó para enfermedades malignas y no malignas [79,80]. Anteriormente, se informó que la sangre placentaria podría usarse como fuente de células madre hematopoyéticas para el trasplante en receptores no relacionados [81,82]. La transducción de células T derivadas de UCB con el h8F4-CAR demostró su capacidad para matar células leucémicas de manera dependiente de PR1/HAL-A2. El desarrollo exitoso y los resultados preclínicos de h8F4-CAR tienen el potencial de una nueva terapia de células T dirigida contra un autoantígeno endógeno que se expresa diferencialmente en la superficie celular de las células madre leucémicas.

3.6. Células CAR-T dirigidas por anti-CD70 para la LMA

CD70 es un objetivo prometedor para la terapia de células CAR-T contra la LMA porque se expresa en células a granel de LMA, células madre leucémicas (LSC) y tiene poca o casi ninguna expresión en células hematopoyéticas normales (HSC) y células normales de la médula ósea [83]. CD70 pertenece a la familia TNF-alfa y recientemente ha ganado importancia como antígeno diana de superficie celular para la LMA [84]. Reither et al. demostraron que los pacientes con LMA tratados con un agente hipometilante (HMA) tenían una expresión de CD70 regulada al alza en las LSC. Con la ayuda de un anticuerpo monoclonal humano (mAb) para CD70, cusatuzumab, se intentó bloquear la interacción CD70/CD27. Este estudio ha mostrado resultados prometedores in vitro e in vivo (modelo PDX) al eliminar las LSC a través de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Estos resultados preclínicos condujeron a un ensayo clínico de fase I en combinación con Azacitidina HMA. Decepcionantemente, la fase II resultó en que las tasas de CR de cusatuzumab fueran menos de la mitad de las observadas en la fase I [85]. Recientemente, Sauer et al. han demostrado el potencial de las células CAR-T específicas de CD70 contra la LMA sin causar toxicidad por HSC [86]. En este estudio, se realizó un análisis comparativo para CD70 CAR (full length-CD27 fusionado a CD3ζ) entre las células CAR-T CD70scFv. Entre los parámetros estudiados para evaluar estos CAR, la mejora de la actividad tumoral, así como un mayor potencial de proliferación, fue indicado por las células CD27z-CAR-T. Un estudio dirigido por Qong J Wang et al. utilizó CAR de segunda generación que incluían el dominio coestimulador 4-1BB, que se pensaba que era superior a los CAR de primera generación [87]. Entre los diversos constructos utilizados en este estudio, los constructos de células CAR-T 41BB y CD3ζ (trCD27-4 1BBζ) conferían la mayor producción de IFNγ contra tumores que expresan CD70 in vitro. Del mismo modo, un modelo de ratón xenoinjertado in vivo con tumores humanos que expresan antígeno CD70 mostró resultados prometedores. En la reunión de la Sociedad Americana de Hematología (ASH2021), se presentó un estudio en curso en el laboratorio de Marcela Maus sobre células CAR-T dirigidas por CD70 para la LMA [88]. La investigación ha utilizado el modelo NSG Molm13 AML para evaluar la actividad antitumoral de las células CAR-T. La actividad de las células CD70-CAR-T se atenuó debido a la forma soluble del ligando, CD27, que se confirmó en el ensayo de cocultivo de LMA. Para superar esta limitación del ligando soluble, se evaluó una gama de nuevas variantes car de bisagra (truncadas, eliminadas, flexibles y «CD8hinge&TM»). En comparación con las células CAR-T nativas basadas en 41BB, la variante CD8hinge&TM ha mostrado una marcada mejoría en los cultivos in vitro con mayor citólisis de los objetivos de LMA. Además, las células CD8hinge&TM CAR-T habían mostrado una expansión in vivo superior y fueron capaces de mediar la eliminación de la LMA en el modelo PDX en comparación con las células CAR-T nativas.

3.7. Terapia anti-TIM-3 CAR para la LMA

Incluso después de la quimioterapia, la razón de la recaída de la leucemia se ha relacionado con la rara fracción resistente a la quimioterapia de las LSC que proliferan para desarrollar blastos de leucemia. Hasta ahora, ninguna de las terapias o estrategias de tratamiento convencionales han tenido éxito porque carecen de LSC dirigidas y eliminadas, lo que permite que los clones residuales ganen la capacidad de superar el tratamiento. Recientemente, se descubrió el papel de la inmunoglobulina mucina-3 de células T (TIM-3) en el agotamiento de las células T, que también se correlacionó con el resultado de la terapia anti-PD-1 [89]. Junto con CTLA-4, TIM-3 es otro punto de control inmunológico que podría inhibir la inmunidad al cáncer. TIM-3 como molécula de superficie se expresa en LSC en casi todos los tipos de AML, pero no en HSC. Yoshikane Kikushige et al. han demostrado que, cuando se inyectaron ratones inmunodeficientes con TIM-3 (+) pero no TIM-3 (−), las células de AML condujeron a la reconstitución de AML humana [90]. Esto indicó que la población TIM-3 (+) contiene LSC funcionales que podrían dar lugar a la enfermedad y blastos. Apuntar a TIM-3 para tratar la MRD en pacientes con LMA proporcionaría un beneficio clínico. TIM-3 está altamente expresado en blastos de LMA y LSC en la mayoría de los subtipos de pacientes. La falta de expresión en el tejido normal, así como los granulocitos, linfocitos y la mayoría de las HSC hacen de esta proteína un objetivo ideal. Wen-Hsin Sandy Lee del grupo del Dr. Wang ha generado recientemente una biblioteca de fagos utilizando Fab humano ingenuo y fue capaz de aislar anticuerpos TIM antihumanos. Utilizando scFv de este anticuerpo, se desarrolló un TIM3 de redirección de células CAR-T de segunda generación, que mostró actividad antileucémica contra líneas celulares, así como blastos primarios de AML [91]. Las células CAR-T anti-TIM3 fueron capaces de suprimir el crecimiento de células leucémicas in vivo. El NSG fue injertado con la línea celular CMK, generando así un modelo de xenoinjerto. La bioimagen que mide la actividad de la luciferasa indicó la infiltración de la línea celular en la médula ósea, el bazo y el hígado. Durante el tratamiento, se observó supresión del crecimiento tumoral, lo que sugirió el aclaramiento del tumor. Los niveles de los efectores de citotoxicidad como IFN-γ, granzima B, perforina, GM-CSF e IL-5 se elevaron significativamente en comparación con el grupo de control (modelo tumoral desarrollado por A11). El estudio demostró la eliminación eficiente de las LSC primarias aisladas directamente de los pacientes. Por lo tanto, la terapia de células T car anti-TIM-3 después del tratamiento de primera línea puede mejorar los resultados clínicos de los pacientes con LMA. Xin He et al. también habían presentado su trabajo sobre células CAR-T biespecíficas y divididas, TIM3 y CD13 para atacar y eliminar la LMA [92]. Además, el método secuencialmente seleccionado de anticuerpos y antígenos (STAR) seleccionado por el tumor podría identificar nanocuerpos que se unirían a la LMA, los nanocuerpos Nb157 aislados por STAR se unen específicamente a CD13, que está altamente expresado en las células de LMA, y las células CAR-T CD13 eliminaron potentemente la LMA in vitro e in vivo. Las células CAR-T dirigidas biespecíficamente a CD13 y TIM3, que están reguladas al alza en las LSC, eliminaron la LMA derivada del paciente al tiempo que redujeron la citotoxicidad de las células madre y las células mieloides periféricas en modelos de ratón. Estos hallazgos podrían conducir al desarrollo de un tratamiento eficaz contra la LMA CAR.

3.8. CD93 como objetivo para CAR-T AML

CD93 es un receptor transmembrana de lectina de tipo C que desempeña un papel no solo en los procesos de adhesión célula-célula, sino también en la defensa del huésped. Coustan-Smith et al. han publicado un estudio que explica detalladamente el monitoreo de la enfermedad residual mínima (MRD) en la LMA [93]. El informe consideró una expresión de todo el genoma de las células de LMA de los pacientes y la comparó con individuos sanos. El estudio ha esbozado dos conjuntos de datos principales, que se basan en la expresión aberrante de genes seguida de análisis citométricos de flujo de mieloblastos leucémicos y no leucémicos de la médula ósea. Casi veintidós marcadores putativos han mostrado una expresión aberrante en muestras de LMA. Muchos de estos marcadores son bien conocidos en la leucemogénesis (marcadores asociados a la leucemia) y actualmente se utilizan para la identificación de la LMA (diagnóstico de leucemia) [94]. Entre estos 22 marcadores, CD93 tiene un perfil de expresión interesante. Aunque CD93 no se expresa en HSC ni en ninguna otra población mieloide precursora, aparentemente se expresa en otra gama de células inmunes, incluidos neutrófilos (CD15), monocitos (CD14) y células mieloides maduras [95]. La falta de expresión en células B (CD19), células T (CD3), glóbulos rojos (CD235a) y plaquetas (CD41a) ha hecho que el marcador CD93 sea de interés adicional. Recientemente, Richards et al., en colaboración con el Dr. Majeti, diseñaron células CAR-T, que han demostrado fuerza antileucémica, dirigidas a CD93 utilizando un nuevo aglutinante humanizado específico de CD93 [96]. El modelo in vivo no reveló toxicidad hacia HSC y células progenitoras. Aunque hay una falta de expresión de CD93 en HSC, se expresa ampliamente en células endoteliales humanas residentes en tejidos, y las células T CAR CD93 pueden identificar y provocar una respuesta «fuera del objetivo» a las líneas celulares endoteliales. Para abordar este desafío, se aplicó otra estrategia booleana para evitar la reactividad cruzada específica del endotelial. Los autores han proporcionado una prueba de concepto para las células CAR-T CD93 «NO cerradas» que eluden la toxicidad de las células endoteliales en un sistema modelo relevante. Brevemente, las células CAR-T CD93 pueden eliminar específicamente la LMA y los HSPC de repuesto, pero ejercen toxicidad en el objetivo y fuera del tumor para las células endoteliales. La agrupación de Aproximación y Proyección de Variedad Uniforme (UMAP) indicó el patrón de expresión de CD93 en células enodteliales humanas, que fue respaldado por la evaluación de IHC de tejidos de varios órganos, como el páncreas, la piel, el diafragma y el corazón. Para evitar la focalización de los tejidos enoteliales y causar toxicidad, los autores diseñaron preferentemente CAR con puerta no lógica. Se generó un modelo in vitro para probar la especificidad de este constructo inhibidor no CAR (iCAR) basado en CAR. Este modelo se basa en la línea celular de células endoteliales de la vena umbilical humana inmortalizada (iHUVEC) que expresa CD19 truncado (dominio extracelular y transmembrana): iHUVEC-19, que está dirigido por iCAR específico de CD19. El diseño del nuevo iCAR incluyó scFv específico de CD19, un endodominio de señalización transmembrana CD8alpha a partir de proteínas inhibidoras basadas en tirosina inmunorreceptora (ITIM), incluyendo PD-1 e inmunorreceptor de células T con Ig (TGIT). No se incluyó ningún dominio de señalización intracelular (Pdel) como control. Las células T que expresan CAR caRs de activación (aCAR expresando el dominio coestimulador CD28 de endodominio con CD3ζ dirigida a CD93) que coexpresan iCARs fueron cocultivadas con THP-1, iHUVEC e iHUVEC-19, respectivamente. Los análisis comparativos entre iCAR/aCAR y los constructos de control (CD93-28-CD3ζ/Pdel-1) demostraron significativamente menos secreción de IFNg e IL2 cuando se cocultivaron con iHUVEC-19, mientras que se informaron niveles similares de estas secreciones de citoquinas cuando se cocultivaron con la línea celular THP-1 (AML). Se ha demostrado que los iCARs basados en TGIT inducen la inhibición de la citoquina en presencia de dos dianas, CD19 y CD93, mientras que el constructo conserva la funcionalidad después de la identificación de las células iHUVEC e iHUVEC-19, lo que indica una señalización inhibitoria basal independiente del antígeno. Los autores han identificado otros 232 objetivos candidatos para un trabajo NOT-gate basado en iCAR. Se requeriría una validación en profundidad de iCAR basada en la expresión de la superficie celular en células normales. Es imperativo confirmar la falta de expresión del antígeno objetivo y la modulación del diseño para atacar la LMA.

Antígenos diana de puerta NO expresados selectivamente en el tejido de reactividad cruzada para propagar una señal inhibitoria que interfiere con la señal de activación de células T CAR [97].

En general, el estudio ha demostrado la coexpresión de otros objetivos de LMA en células endoteliales, ha introducido una nueva estrategia NO cerrada para mitigar la toxicidad endotelial y ha demostrado el uso de perfiles transcriptómicos de alta dimensión para el diseño racional de inmunoterapias combinatorias. Si bien el estudio de prueba de concepto ha demostrado la importancia de los CAR basados en NOT-gate, se requeriría un modelo PDX para traducir la comprensión y resolver el nuevo conjunto de desafíos.

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4. Limitaciones y desafíos

4.1. Toxicidades

Las células T modificadas con CAR son potentes y han demostrado potencial de toxicidad «en el objetivo fuera del tumor» en los casos en que el objetivo antigénico se coexpresa en células normales, como con antígenos asociados a la leucemia. Los principales efectos clínicos de toxicidad tisular intermitente para las células CAR-T dirigidas a CD19 incluyen el síndrome de liberación de citoquinas (CRS) [98], que es causado por la activación de las células T y se manifiesta como fiebre de alto grado, hipertensión y síndrome de neurotoxicidad asociada a células efectoras inmunes (ICANS) que se asocia con disfunción de células endoteliales en la barrera hematoencefálica causada por hiperinflamación [99,100 ]. Se han reportado efectos adicionales como complicaciones cardiovasculares, síndrome de fuga capilar asociado con hipoxia, disfunción renal ocasional y coagulopatía [2,101,102]. En una revisión reciente sobre el CRS y el ICANS en inmunoterapia contra el cáncer, Morris et al. han destacado las causas fisiopatológicas detrás de las neurotoxicidades y el desarrollo de nuevas terapias para la prevención y / o el manejo de estas toxicidades [98].

4.2. Pérdida de antígeno

Aunque ha habido un rápido progreso de la terapia de células CAR-T, la resistencia al tratamiento se ha convertido en una barrera importante para su aplicación clínica. Aunque la prueba clave de Novartis CAR con CTL109 (NCT01626495) ha mostrado una notable tasa de respuesta del 93% [103.104], la tasa de respuesta completa a 1 año ha disminuido a alrededor del 55% y sugiere que casi la mitad de los pacientes desarrollaron resistencia en ese período. La pérdida de antígeno objetivo representó la mayor parte de la resistencia en la terapia de células CAR-T. Esto demuestra que dirigirse a un solo antígeno puede no ser suficiente para cualquier terapia de células CAR-T. Ya se ha informado de recaída de variantes de pérdida de epítopos o cambio de linaje después de la terapia de células CAR-T CD19 contra la LLA [105,106] y pocas han mostrado edición de antígenos tumorales en respuesta a la inmunoterapia [107]. La mayoría de los beneficios clínicos de las células CAR-T han llegado con pacientes que sufren de LLA recurrente, especialmente en el caso de Emily Whitehead, que actualmente tiene casi 10 años de supervivencia libre de cáncer. Las ventajas potenciales de las células T modificadas con CAR sobre los anticuerpos monoclonales incluyen una mayor citotoxicidad, tráfico activo, paso a través de la barrera hematoencefálica, menos dosis requeridas, el potencial de memoria de larga duración y protección contra la recaída, y una mayor sensibilidad a la baja densidad de antígenos [63,101,108].

4.3. Modelos preclínicos

Aunque se cuantifican funciones básicas in vitro como la proliferación, la lisis diana de antígenos, la producción de citoquinas y el ensayo de estimulación basado en antígenos, estos ensayos no necesariamente resultan traducirse de manera eficiente con rendimientos in vivo. La validación del diseño de células CAR-T se realizó mediante el injerto del modelo preclínico de ratón con células T transferidas adoptivamente. Aunque estos modelos de ratón han demostrado una eficiencia improvisada para eliminar la carga de células tumorales, el microambiente inmune dentro de un ratón y los órganos linfoides humanos difieren en gran medida entre sí. Debido a estas limitaciones, se utilizó un método alternativo para evaluar las células CAR-T que pueden transferirse adoptivamente a ratones inmunocompetentes. Este modelo de ratón no necesariamente se traduce bien en el rendimiento de las células T humanas. Inicialmente, la eficiencia de la terapia de células CAR-T en modelos de ratón carecía gravemente para traducirse en ensayos clínicos [49,109,110]. Por último, los modelos de ratón también tienen un inconveniente en el que no pueden evaluar la reactividad cruzada contra los tejidos humanos sanos que podrían expresar el antígeno objetivo sistémicamente a niveles de expresión bajos.

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5. Futuro de la terapia de células CAR-T con LMA

Actualmente, hay aproximadamente más de 190 ensayos clínicos en curso en el campo de la inmunoterapia. La evaluación funcional de las células CAR-T ha ido progresando, donde los resultados de estos experimentos se han formulado en ensayos clínicos de fase I. Con cada ensayo, se ha logrado un progreso significativo en la comprensión de la biología de las células CAR-T. Se están realizando esfuerzos actuales en el diseño de construct, así como en otras áreas, para construir un sistema modelo robusto con una actividad antileucémica superior con una citotoxicidad celular más baja (Figura 3).

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Figura 3

Estrategias preclínicas de bioingeniería para improvisar los CAR: Se está llevando a cabo un enfoque experimental con modelos in vivo inmunocomprometidos para mejorar la especificidad y la orientación de antígenos cognados. Estos esfuerzos se mitigan para reducir la toxicidad y aumentar la validación del modelo preclínico. Pocas de estas modificaciones están bajo investigación para revertir el agotamiento. (A) La revitalización de las células CAR-T ha llevado a una mayor persistencia, así como a una resistencia inversa a la exposición secundaria de antígenos. La activación crónica de las células CAR-T conduce a fenotipos exhaustivos. La inhibición transitoria («reposo») de la señalización CAR ha restaurado el fenotipo funcional, lo que se demostró mediante la reprogramación transcripcional y la remodelación epigenética. La expresión ectópica forzada de c-Jun y la deleción del factor de transcripción (NR4a) que conduce al agotamiento han revertido y restaurado el antitumoral hasta cierto punto. Los CAR blindados que secretan bloques de puntos de control inmunes se mejorarán aún más al desencadenar las roturas en las células CAR-T. La modificación más importante identificada en todos los ensayos clínicos consistió en la citotoxicidad mediada por CAR. (B) La combinación de IL15 secretor car y virus oncolíticos se ha configurado recientemente para eliminar las células tumorales. La evolución de los CAR de tercera generación con la integración de múltiples dominios coestimuladores (por ejemplo, CD137 (4-1BB)) mostró una mejor persistencia de los CAR en comparación con CD28. Los CAR de cuarta generación tienen la capacidad de secretar constitutivamente citoquinas, como IL-12, IL-18, IL-21, que tienen la capacidad de amplificar y expandir los CAR, así como de autorregular en un entorno específico. (C) Para reducir esta citotoxicidad, se diseñaron interruptores suicidas (iCasp9), CAR adaptadores (RevCARs) y Switch-CARs. Se desarrolló una molécula pequeña y CAR regulables con un interruptor de encendido / apagado para minimizar la toxicidad adicional. Se desarrollaron «AND» logic gating, (por ejemplo, synNotch) y CAR biespecíficos para reducir la «citotoxicidad tumoral en el objetivo». La sobreexpresión del eje CXCR2/CCR2b y CXCR5 se expresó para redirigir el tráfico de CAR al sitio del tumor y aumentar la movilidad a ubicaciones sistémicas. La cotransducción de CAR con varios scFv dirigidos a múltiples antígenos se diseñó para reducir la citotoxicidad y aumentar la especificidad de unión al tumor. (D) Se utilizaron scFvs CAR en tándem (por ejemplo, CD19/CD20, CD19/CD22) para mejorar la especificidad del objetivo. Los CAR blindados que secretan IL-12 e IL-18, así como los CAR dirigidos al estroma tumoral, han marcado recientemente una inmensa diferencia en la modulación del microambiente tumoral. (E) Diseño Split-CAR que permite la ingeniería de células CAR-T de múltiples características, con el objetivo de abordar los desafíos actuales que limitan la seguridad y eficacia de las células CAR-T para el tratamiento del cáncer (un CAR dividido, universal y programable (SUPRA)).

5.1. Tunning fino

Los desafíos estructurales y fisiológicos a través de trabajos previos han justificado estas modificaciones de los CAR. Se han adoptado múltiples enfoques para modificar el diseño para mejorar las especificidades de la orientación tumoral, como el ajuste fino de las células CAR-T sinérgicamente, el suministro de proteínas inmunomoduladoras adicionales para mejorar la potencia, la improvisación del tráfico celular y la persistencia para avanzar en la terapia de células CAR-T. Las revisiones detalladas que resumen todos estos factores están fácilmente disponibles en la literatura [111,112]. En resumen, la modificación de la columna vertebral estructural se puede hacer a través de un coestimulador adicional, un inhibidor o algunos dominios reguladores para mejorar la función. El ajuste fino funcional de car se realiza a través de enfoques de bioingeniería para mejorar y mitigar la toxicidad mediada por CAR. Se están realizando esfuerzos específicos en relación con la longitud del espaciador, los dominios transmembrana, la secuencia de señalización y la orientación de múltiples antígenos a través de una variedad de estrategias de «gating». Como se mencionó anteriormente, algunos estudios involucraron una secreción inducible transgénica adicional de las citoquinas inflamatorias que se ha incluido en el constructo, que está destinada a modificar el microambiente tumoral (TME) al mejorar la presentación cruzada del antígeno y promover la propagación del epítopo. Estas células T se redirigen para la muerte universal mediada por citoquinas TRUCK o células CAR-T «blindadas» mediante la expresión de IL-12 [59,113], IL-18 [114] o CD40L [115,116].

5.2. Mejora de la seguridad y minimización de la toxicidad

La idea de una estrategia de focalización de múltiples antígenos se basa en la lógica booleana. La lógica booleana se aplica para «bloquear» la actividad de las células CAR-T para maximizar el potencial de unirse al antígeno objetivo y reducir la toxicidad fuera del tumor para las células espectadoras. Las puertas lógicas son un conjunto de dos receptores de superficie diferentes expresados en una célula CAR-T para identificar dos antígenos separados para discriminar entre las células diana y las células sanas. Una estrategia incorpora dos receptores separados, uno con un endodominio de CD3ζ, mientras que el otro receptor contiene un dominio coestimulador. Kloss et al. han demostrado la activación y coestimulación mediada por el receptor quimérico dual de las células T humanas que condujo a una citotoxicidad robusta y una reducción eficiente de la carga tumoral dirigida a PSMA y PSCA [117]. Este estudio condujo a la excavación del concepto de la estrategia de «detección de tumores». Esta estrategia podría ayudar a evitar los efectos secundarios fuera del tumor, ya que el tumor con ambos antígenos se eliminará selectivamente en comparación con el antígeno único. La puerta lógica (i) «OR» es donde se instalan las moléculas CAR completamente independientes para reconocer la presencia de un solo antígeno o ambos antígenos simultáneamente. Por el contrario, se agrupan múltiples CAR-T (con dominios coestimulantes) para coexpresarse específicamente para identificar antígenos objetivo, lo que permite a las células CAR-T prevenir el escape tumoral al dirigirse a cualquiera de los antígenos. ii) Puerta lógica «AND»: dos CAR distintas se coexpresan en una sola célula T con dominios de señalización complementarios; de los dos CAR, si uno cumple el objetivo con la ausencia del otro objetivo, el CAR-T quedaría inactivo. La célula CAR-T solo obtendría el estado de activación completa al unir sus antígenos cognados simultáneamente. Roybal et al. proporcionaron una prueba de concepto con el diseño meticuloso de circuitos combinatorios de células T de reconocimiento de antígenos, receptores sintéticos Notch (synNotch) [118] (Figura 2B). Con el reconocimiento del primer antígeno por el primer receptor, un factor de transcripción desencadenaría la inducción/expresión de un segundo CAR, que luego se unirá al antígeno secundario, completando así el circuito. En resumen, estas células CAR-T de doble receptor solo se arman y activan después de unirse a ambos antígenos en las células cancerosas (AND-gate) [119]. Los intrincados diseños experimentales dirigidos a dos antígenos con synNotch (CAR-T dual) podrían unirse sinérgica y selectivamente, para evitar que la toxicidad fuera del tumor activado por el objetivo active los CAR. El experimento in vitro con la bioingeniería de la doble focalización específica de CD19 y mesotelina ha demostrado que las estrategias synNotch CAR provocarían un efecto antitumoral [120]. Si bien estos sistemas multi-CAR son un enfoque emocionante e importante para mejorar la orientación tumoral, una gama más amplia de estrategias de detección combinatoria mejorará la capacidad de tratar una variedad de tumores y enfermedades con terapias de células T [121]. iii) Además, mediante la aplicación de la puerta lógica «NOT» (sección 3.8), las células T pueden diseñarse para diferenciar las células diana de las células no objetivo, lo que evitará ataques al tejido normal y dará lugar al logro de la seguridad de las células CAR-T.

Un CAR-T universal (UniCAR) se deriva de células CAR-T de segunda generación, que utilizan CD28 como dominio coestimulador (Figura 2F). El diseño se divide en dos componentes. Primero, un scFv único que no se une directamente a la célula cancerosa (TAA), sino que identifica un motivo peptídico en una molécula adaptadora. En segundo lugar, esta molécula adaptadora soluble llamada «módulo de orientación» (TM) está configurada para identificar y unir CD123, que liga en un extremo al TAA y en el otro extremo al receptor CAR-T. La MT confiere especificidad contra taA y debido a su alta flexibilidad para la unión a TAA, puede dirigirse a neoplasias malignas hematológicas heterogéneas como la LMA. Un estudio preclínico con el sistema UniCAR-T ha demostrado que incluso pequeñas cantidades de MT pueden inducir la lisis de las células tumorales junto con la liberación de la citoquina [88]. Este estudio dirigido por Cartellieri et al. proporcionó una «prueba de concepto» para UniCAR reorientando células T humanas diseñadas por UniCAR contra los antígenos AML CD33 y CD123 utilizando una nueva plataforma modular. El fármaco UniCAR02-T-CD123 es una combinación de un componente celular (UniCAR02-T) con un derivado de anticuerpos recombinantes (TM123), que juntos forman el fármaco activo. Un ensayo clínico de fase I utilizando células T UniCAR dirigidas a CD123 para el tratamiento de neoplasias hematológicas y linfoides cd123 positivas ha arrojado algunos resultados impresionantes (NCT04230265) [89].

Un sistema CAR dividido, universal y programable (SUPRA) para la terapia de células T tiene la capacidad de cambiar de objetivo sin rediseñar las células T, ajustar finamente la fuerza de activación de las células T y detectar y responder lógicamente a múltiples antígenos [120,122] (Figura 2E)). Debido a la fuerza de activación de las células T ajustada, se observó una citotoxicidad reducida mientras se realizaban múltiples funciones. SUPRA CAR puede detectar y responder lógicamente a múltiples antígenos para combatir la recaída, así como la capacidad de controlar la señalización específica del tipo de célula. La mayor ventaja de los CAR SUPRA es su capacidad para impartir una inmunogenicidad mínima mientras se dirige a los antígenos asociados al tumor. La controlabilidad programable en el diseño del constructo, se debe al sistema de dos componentes, por lo que se denomina como CARs divididos. El sistema split-CAR está compuesto por fragmentos «zipCAR» y «zipFv» (Figura 2E). El zipCAR contiene dominios de señalización intracelular conectados a través de un segmento transmembrana a una cremallera de leucina extracelular. El zipFv contiene un dominio scFv de unión a ligando fusionado a una segunda cremallera de leucina. Un CAR funcional se reconstituye cuando se agregan proteínas zipFv a las células T modificadas que expresan zipCARs con cremalleras de leucina coincidentes.

5.3. Modulación del microambiente tumoral

La inclusión de «accesorios» junto con CAR, como factores inmunomoduladores que conducen a la secreción de citoquinas, receptores de quimiocinas, receptores sintéticos y el bloqueo de inhibidores de puntos de control (anti-PD-1 scFv), ha mejorado la eficacia de las células CAR-T. Las revisiones de la elección del dominio coestimulador y las diferencias en la actividad diversa, la persistencia, el metabolismo, el fenotipo de memoria y la caracterización extensa, así como el inmunofenotipo, han sido bien documentadas para los CAR [61,123,124]. La nueva lista de dominios coestimuladores y su repertorio funcional se están investigando activamente [125]. Algunos de estos consisten en CD40, OX-40 [126] (CD134), ICOS (CD278) y CD27 [127]. Por último, la investigación centrada se realiza en revertir el estado agotado de las células CAR-T, así como la persistencia / mantenimiento de las células CAR-T como un subconjunto de memoria para cosechar una mejor eficacia terapéutica. El agotamiento de las células T se caracteriza por una mayor expresión de los receptores inhibitorios, así como por alteraciones transcripcionales y epigenéticas generalizadas [128]. Eyquem et al. demostraron que la inserción de transgenes CAR utilizando la tecnología de edición del genoma CRISPR / Cas9 en el receptor de células T α locus constante (TRAC) se produjo en la expresión de CAR en células T [129] (Figura 1: quinta generación de diseño CAR). Esta mejora ha resultado en una mayor potencia de las células T, en comparación con las células CAR-T convencionales en un modelo de ratón de ALL.

5.4. Reactivación de la función CAR T

La reexpresión del CAR, seguida de una exposición única o repetida al antígeno, retrasó la diferenciación de las células T efectoras, así como el patrón de agotamiento [130]. Se ha demostrado que la sobreexpresión del factor de transcripción c-Jun protege a las células T del agotamiento incluso de los diseños CAR más agotadores [131,132]. Weber et al. han demostrado que los clones expandidos de células CAR-T crónicamente agotados a través de la señalización tónica tienen distintas características de agotamiento [133]. Una molécula pequeña inerte dasatinib, inhibidor de la tirosina cinasa, que suprime la activación de las células T a través de la inhibición de las quinasas de señalización del receptor proximal de células T (TCR), como Src, Fyn y Lck, fue aprobada por la FDA [133]. En estudios preclínicos y clínicos, se ha demostrado que dasatinib previene o revierte el agotamiento de las células T [134]. Un estudio detallado ha descrito que el estado de inhibición transitoria de la señalización celular CAR-T en presencia de dasatinib reveló un fenotipo similar a la memoria con una actividad antitumoral mejorada en una transferencia adoptiva a un modelo de ratón xenoinjerto. Las células CAR-T pre-agotadas restauraron el fenotipo funcional antitumoral con la inducción de «reposo» durante tan solo 4 días, indicado a través de la reprogramación transcripcional y la remodelación epigenética. La duración del «reposo» se asoció con una disminución de la expresión del factor de transcripción tox asociado al agotamiento y una expresión elevada de los factores de transcripción asociados a la memoria LEF1 y TCF1. El rejuvenecimiento funcional dependió de la actividad de la histona metiltransferasa EZH2, que fue consistente con la remodelación epigenética en respuesta al «reposo» (Figura 3A). En conclusión, un pequeño período de «reposo» o inhibición de la señalización CAR podría restaurar la actividad de las células CAR-T, así como mejorar la aptitud de las células CAR-T al prevenir el agotamiento. La regulación de las células CAR-T modificadas con inhibición intermitente podría traducirse en células CAR-T clínicas. Una revisión reciente de Weber et al. ha cubierto la mayoría de las próximas estrategias asociadas con las terapias de células inmunes [135]. Lui et al. introdujeron una construcción de receptor de interruptor genéticamente modificada, que comprende el dominio extracelular truncado de PD1, la transmembrana y los dominios de señalización citoplasmática de CD28 en células CAR-T. Este receptor de «interruptor» convierte las señales supresoras inducidas por el tumor PD-L1 en señales de activación [136].

5.5. CAR extensibles y adaptables

Estos resultados prometedores han demostrado la funcionalidad y la conmutabilidad de los sistemas de células T CAR adaptadoras por primera vez en humanos en un ensayo clínico [137]. Dada la heterogeneidad de la expresión de antígenos en las células de LMA, se requieren enfoques de orientación combinatoria para mejorar las herramientas terapéuticas. Utilizando sistemas modulares basados en Ab, se diseñó una plataforma reverse CAR (RevCAR) de adaptador conmutable, flexible y programable [138] (Figura 2G). El sistema UniCAR condujo a la fundación de este estudio, donde la especificidad tumoral se controló con una afinidad reversible de la molécula adoptante que da un joystick para controlar la seguridad en la terapia CAR-T [116,139]. En este estudio, Enrico Kittle-Boselli et al. desarrollaron una célula T RevCAR que puede dirigirse indirectamente a los antígenos tumorales, que pueden controlarse mediante la unión de revCAR-T reticulado de anticuerpos biespecíficos que eventualmente resultan en la lisis tumoral. En resumen, los RevCARs expresan epítopos peptídicos E5B9 o E7B6 en lugar de un SCFv convencional de segunda generación CAR. Estos RevCARs son incapaces de reconocer directamente el antígeno tumoral, sino que se entrecruzan entre módulos diana biespecíficos (RevTM). Estos RevTM consisten en dos scFvs: uno que se dirige al respectivo epítopo RevCAR E5B9 o E7B6 y el otro que se dirige al antígeno tumoral. El adaptador modular en este sistema puede actuar como un control que permite un interruptor de encendido / apagado de la actividad de la célula T RevCAR mediante la dosificación de los RevTM. La reversibilidad de este sistema no solo proporciona una ventaja de la orientación específica, sino que también agrega valor al tiempo que evita las toxicidades fuera del objetivo fuera del tumor, como el CRS.

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6. Conclusiones

En los últimos años, las terapias de células CAR-T han surgido como una nueva clase de terapia 697 en investigación, mostrando resultados impresionantes en neoplasias hematológicas malignas, especialmente en neoplasias malignas de células B. A finales de la década de 1980, Eshhar et al. realizaron experimentos que sirvieron como pilares fundamentales de la inmunoterapia y la ingeniería genética. Los esfuerzos colectivos de varios grupos en todo el mundo, a través de modelos preclínicos de ratón, han dado como resultado mejoras significativas en el tratamiento de la terapia de células CAR-T. Con una mejor comprensión de la biología de las células CAR-T, algunos ensayos clínicos multicéntricos de estas células inmunes mejoradas / modificadas, denominadas células CAR-T o medicamentos «vivos», se utilizaron para tratar a pacientes con neoplasias hematológicas malignas. Este éxito allanó el camino para la aprobación de la FDA de la terapia de células CAR-T para el tratamiento de neoplasias malignas de células B. Hasta ahora, el éxito se ha limitado solo al linfoma, y los tratamientos para la leucemia siguen en libertad. El aprendizaje a través de cada ensayo y estudio de manejo clínico ha proporcionado nuevos desafíos para estos agentes terapéuticos. En el panorama actual de la tecnología de células CAR-T, se llevan a cabo esfuerzos para sinergizar varias plataformas como la radioinmunoterapia [140,141]. La nueva lista adquirida de dianas para tumores sólidos y diversas modificaciones de car se han descrito en otra parte [142,143] Hemos enumerado anteriormente dianas prometedoras selectivas, y esfuerzos que se han realizado en modelos preclínicos. El éxito de los enfoques de bioingeniería, incluidos el gating booleano, la reversión de los agotamientos, la sobreexpresión ectópica de factores de transcripción, los «adaptadores» multiespecíficos, supra CAR, los CAR de conmutación y las plataformas de gating sintético, determinará en última instancia hasta qué punto las terapias celulares inmunes de próxima generación emergen como alternativas eficaces a las medicinas tradicionales.

Publicado por saludbydiaz

Especialista en Medicina Interna-nefrología-terapia intensiva-salud pública. Director de la Carrera Economía y gestión de la salud de ISALUD

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