Effective Separation of Cancer-Derived Exosomes in Biological Samples for Liquid Biopsy: Classic Strategies and Innovative Development

Yujiao Xie,xiawei xu,jie lin,Yanping Xu,JingWang,Yong Ren

La biopsia líquida ha facilitado notablemente el diagnóstico clínico y la vigilancia del cáncer al emplear una forma no invasiva de detectar componentes derivados del cáncer, como el ADN tumoral circulante y las células tumorales circulantes a partir de muestras de fluidos biológicos. Los exosomas derivados del cáncer, que son vesículas de tamaño nanométrico secretadas por las células cancerosas, se han investigado en biopsia líquida, ya que se han revelado sus funciones importantes en la comunicación intracelular y el desarrollo de enfermedades. Dados los desafíos planteados por el complicado microambiente humoral, que contiene una variedad de diferentes células y sustancias macromoleculares además de los exosomas, ha atraído una gran atención para aislar efectivamente los exosomas de las muestras recolectadas. En esta revisión, los autores tienen como objetivo analizar las estrategias clásicas para la separación de exosomas derivados del cáncer, dando una discusión extensa de las ventajas y limitaciones de estos métodos. Además, también se presentan los métodos innovadores de estrategias múltiples para realizar un aislamiento eficiente de exosomas derivados del cáncer en aplicaciones prácticas. Además, en esta revisión se analizan las posibles tendencias de desarrollo de la separación de exosomas en el futuro.

1. Introducción

El cáncer, se ha convertido en una gran amenaza para la vida humana en todo el mundo debido a su alta incidencia y mortalidad. Según los datos globales de cáncer publicados por la Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer, se confirmaron alrededor de 19 millones de nuevos casos de cáncer en 2020, y este número previsiblemente aumentará a más de 32 millones en los próximos 20 años. ^[ 1 ] Según el análisis mundial del cáncer, es probable que uno de cada 5 hombres o mujeres luche contra el cáncer durante su vida, mientras que 1 de cada 8 hombres o 1 de cada 11 mujeres morirá de cáncer. ^[ 2 ]En respuesta a desafíos tan severos, se han invertido esfuerzos universales no solo en la exploración de medicamentos contra el cáncer clínicamente efectivos, sino también en el desarrollo de métodos confiables para realizar el diagnóstico y la vigilancia del cáncer. La biopsia de tejido es una herramienta importante para el diagnóstico del cáncer y las muestras de tejido se obtienen directamente de los sitios del tumor de los pacientes y luego se tratan para pruebas patológicas. Ha sido el estándar de oro para el diagnóstico del cáncer durante mucho tiempo. Sin embargo, este método ha mostrado algunas limitaciones en la práctica clínica. En primer lugar, el proceso de operación es invasivo y sofisticado, lo que puede provocar un gran dolor en la mayoría de los pacientes. ^[ 3 ]Además, debido a la heterogeneidad del tumor, las muestras obtenidas por biopsia de tejido pueden no describir de manera efectiva las características generales del tumor. Estas desventajas aparentemente limitan la precisión de la detección del cáncer y aumentan la dificultad en la detección dinámica del tumor. ^[ 4 ]Para facilitar la detección del cáncer, se ha desarrollado ampliamente otro método novedoso, la biopsia líquida. Este enfoque tiene como objetivo obtener y analizar información sobre la enfermedad a partir de componentes derivados del cáncer, que incluyen principalmente células tumorales circulantes (CTC), ADN tumoral circulante (ctDNA) y exosomas. 

Las fuentes de muestra son los fluidos corporales, que incluyen sangre, orina y saliva, y se recolectan de una manera relativamente no invasiva, como la extracción de sangre o la recolección de orina, lo que podría reducir en gran medida el sufrimiento de los pacientes. ^[ 5 ] Además, también se informó que la biopsia líquida puede presentar todo el panorama genómico del tumor y se puede superar el problema de la heterogeneidad del tumor. ^[ 6 ]Más importante aún, la biopsia líquida es una prueba repetida a largo plazo, lo que proporciona un método conveniente para monitorear el cambio dinámico y los efectos terapéuticos del tumor. ^[ 7 ] La Figura 1 ilustra el recurso de muestra común y los objetivos de detección de la biopsia líquida.

Ashworth propuso por primera vez el concepto de CTC en 1968, y luego se definió como células tumorales que se propagan desde el sitio primario a la sangre periférica. Las CTC tienen una estructura celular completa y se consideran la principal base biológica para la metástasis hematógena de un tumor maligno. ^[ 8 ] El número de CTC está estrechamente relacionado con el pronóstico de los pacientes, lo que se ha demostrado en el seguimiento posterior al tratamiento de varios tipos de cáncer, como el cáncer de mama, ^[ 9 ] el cáncer de próstata, ^[ 10 ] y el cáncer de colon. ^[ 11 ]Sin embargo, debido a la rareza y heterogeneidad de las CTC en circulación, la aplicación de las CTC sigue siendo un gran desafío para el análisis molecular y el diagnóstico del cáncer. ^[ 12 ]

En 1948, Mandel y Metais informaron por primera vez de la existencia de ADN libre circulante (cfDNA). ^[ 13 ] Después de décadas, los investigadores descubrieron que la cantidad de cfDNA estaba relacionada con el desarrollo de tumores y luego se confirmó y secuenció con éxito el ctDNA. En los últimos años, se ha descubierto que el ctDNA tiene un valor de aplicación importante en la detección temprana del cáncer de pulmón de células no pequeñas ^[ 14 ] y el seguimiento dinámico del cáncer de mama, ^[ 15 ] el cáncer de ovario ^[ 16 ] y el cáncer de esófago. ^[ 17 ]Sin embargo, la cantidad de ctDNA en la etapa temprana del tumor sigue siendo muy pequeña y el tiempo de vida media es bastante corto (0,26 < t _1/2  < 2,5 h). Además, el proceso de extracción y secuenciación de ctDNA cuesta mucho dinero y tiempo, lo que restringe en gran medida su aplicabilidad.

El exosoma es un tipo de vesículas extracelulares (EV) secretadas por las células madre y equipadas con una membrana biológica completa que contiene varias proteínas y ácidos nucleicos. Johnstone lo descubrió por primera vez durante la maduración de los reticulocitos en 1987. ^[ 18 ]Durante mucho tiempo, los exosomas solo se habían considerado como vehículos de transporte que transportaban desechos celulares, y solo se habían realizado unos pocos estudios sobre exosomas. El papel de los exosomas en la respuesta inmune, la comunicación intercelular y la transmisión de información genética no se reconoció hasta finales del siglo XX. Luego, el Premio Nobel de Fisiología y Medicina de 2013 se otorgó a tres científicos (Prof. James E. Rothman, Randy W. Schekman y Thomas C. Südhof) que habían aclarado el mecanismo de regulación de los exosomas en las células, incluidos

i) los genes necesarios involucrados en el transporte de vesículas,

ii) el mecanismo de operación de la proteína de la fusión de la vesícula y la célula diana para entregar información, y

iii) el mecanismo del sistema de señalización para dirigir con precisión la vesícula para que libere moléculas biológicas. ^[ 19] 

Hay dos tipos de vehículos eléctricos que han sido reconocidos. Uno son las microvesículas (MV) que se secretan directamente de la membrana celular mediante la «gemación» con un tamaño de partícula de 100 a 1000 nm. El otro tipo de EV es el exosoma (30–150 nm, hasta 10 ¹¹ mL – ¹ ), que se origina a partir de vesículas endocíticas y se derrama a través de la fusión con la membrana celular después de ser liberado por endosomas tempranos y cuerpos multivesicales (MVB). Después de ser secretados por las células madre, los exosomas utilizan sus proteínas transmembrana o ligandos lipídicos para ejercer actividades biológicas pleiotrópicas con los receptores correspondientes en otras células y luego transfieren proteínas citoplásmicas y ácidos nucleicos a los receptores a través de la fusión de membranas. ^[ 20 ]En base a esto, se ha informado consecutivamente que el exosoma desempeña un papel crucial en la aparición y el desarrollo del cáncer, incluida la progresión tumoral, la metástasis y la facilitación del escape inmunitario. ^{[ 21 – 23 ]} En el estudio sobre el diagnóstico biológico del cáncer de páncreas temprano, los biólogos identificaron con éxito el glipicano-1 (GPC1) como un proteoglicano, que se enriqueció específicamente en la superficie de los exosomas derivados del cáncer. La citometría de flujo se ha utilizado además para monitorear y aislar exosomas positivos para GPC1 en el suero de pacientes con cáncer de páncreas y ratones, y confirma que dichos exosomas tienen una alta especificidad y sensibilidad, lo que puede distinguir a los individuos sanos de los pacientes con cáncer de páncreas temprano y tardío. ^[ 24 ]De manera similar, el concepto de separar y detectar exosomas derivados de tumores como un objetivo importante para la biopsia líquida en el diagnóstico temprano a través de diferentes métodos para distinguir a los pacientes con cáncer de los grupos sanos también se ha realizado en muchos otros cánceres, como el cáncer de mama, ^[ 25 ] hígado cáncer, ^[ 26 ] cáncer de próstata, ^[ 27 ] y cáncer de ovario. ^[ 28 ]

Hacer un uso completo de los exosomas en el diagnóstico y tratamiento del cáncer implica dos pasos indispensables: i) la separación efectiva de los exosomas de las muestras biológicas y ii) el análisis preciso de su contenido de proteínas y ácidos nucleicos mediante análisis posteriores, como transferencia Western y reacción en cadena de la polimerasa.

En la actualidad, la fuente más utilizada en la clínica para la biopsia líquida del cáncer es la sangre. Es bien sabido que la composición de la sangre es compleja y variada, ya que además de los EV, también existen una gran cantidad de células diferentes, como trombocitos, hemameba y eritrocitos, y muchas sustancias macromoleculares, como proteínas y ácidos nucleicos, y estos interferentes. suelen mostrar propiedades diferentes en aspectos físicos y biológicos de los exosomas. Está bastante claro que solo cuando los exosomas se extraen de manera efectiva de las muestras se pueden realizar análisis posteriores y presentar información sobre la enfermedad. Por lo tanto, se ha convertido en un importante campo de investigación y ha atraído muchos esfuerzos para eliminar sustancias no deseadas y enriquecer los exosomas de orientación.

Una vista panorámica del estado actual de la investigación de los exosomas revela dos estrategias principales que se han formado gradualmente en el campo del aislamiento y la detección de exosomas. Una es descartar los exosomas totales en función de sus características físicas, como la densidad y el tamaño, con la ayuda de la fuerza centrífuga, la gravedad y los campos aplicados. Las proteínas y el ácido nucleico contenidos se pueden extraer posteriormente para realizar análisis moleculares posteriores a fin de comparar las diferencias entre las muestras; ^[ 29 ]el segundo es utilizar el principio de afinidad para capturar específicamente los exosomas requeridos mediante un reconocimiento especial entre los marcadores de proteínas en la superficie de los exosomas y sus correspondientes anticuerpos/aptámeros. Finalmente, estos exosomas especialmente seleccionados pueden detectarse y analizarse para obtener información relacionada con el cáncer. ^[ 28 ] Actualmente, varios artículos de revisión han analizado y resumido las estrategias de separación de los exosomas. La mayoría de ellos han aclarado los principios subyacentes a los métodos de separación de exosomas y han comparado sus ventajas y desventajas. Sin embargo, pocos artículos se han concentrado en el aislamiento de exosomas derivados del cáncer y rara vez se ha mencionado la aplicación de estos exosomas en biopsias líquidas de cáncer.

Esta revisión tiene como objetivo resumir las estrategias de separación de exosomas según sus propiedades físicas y demostrar los métodos microfluídicos emergentes desarrollados en los últimos años según el diseño de microestructura y la adición de campos externos. Explicaremos el enfoque de separación basado en la inmunoafinidad y destacaremos algunos métodos multiestrategia integrados. Finalmente, se presentan las conclusiones y perspectivas.

2 métodos de separación de exosomas

Según las propiedades físicas de los exosomas (como densidad, tamaño, solubilidad) y propiedades biológicas (inmunoafinidad), se han propuesto muchos métodos de separación ( Tabla 1). Los métodos de separación convencionales sentaron las bases para la investigación y aplicación del mecanismo patogénico de los exosomas y establecieron el estándar de oro para la separación de exosomas. Sin embargo, estos métodos solo son adecuados para la investigación de laboratorio, ya que los pasos de la operación requieren mucho tiempo y generalmente consumen un volumen relativamente grande de muestras líquidas (unos pocos mililitros de sangre o cientos de mililitros de líquido de cultivo celular). Con el fin de ahorrar tiempo y esfuerzo en la detección de exosomas derivados de tumores, en los últimos años se han desarrollado gradualmente técnicas microfluídicas emergentes utilizadas para aislar exosomas de manera eficiente. ^[ 30 ]En la plataforma de microfluidos para la separación de exosomas, las muestras líquidas recolectadas se procesan en dos patrones básicos. Una es esparcir la solución de muestra en diferentes canales compuestos por varias microestructuras especialmente diseñadas, y luego las partículas biológicas se pueden distinguir de acuerdo con sus diferentes trayectorias de flujo. El otro consiste en separar las partículas de la muestra en función de su propensión a moverse en diferentes direcciones bajo la acción de un campo externo. Dicha plataforma también se denomina laboratorio en un chip, es decir, lab-on-chip. Como resultado, no solo se han publicado muchos logros de laboratorio, sino que también se han desarrollado y emitido algunos productos comerciales por parte de empresas de tecnología. Esta sección aclarará la base teórica de la separación de exosomas y dará ejemplos de métodos de microfluidos tradicionales y emergentes.Tabla 1. Un breve resumen de los diferentes métodos convencionales de separación de exosomas

Principio	Método	Ventaja	Desventaja
Densidad	centrífuga diferencial	Fácil escalado	Daños mecánicos Pérdida de tiempo Laborioso
	Centrifugación en gradiente de densidad	Mayor pureza en comparación con la centrífuga diferencial	Daño mecánico, carga de trabajo engorrosa
Solubilidad	Precipitación	Facilidad de uso ahorro de tiempo	Contaminación de proteínas y polímeros
Tamaño	Separación de membranas	Alta pureza	Volumen limitado
	Cromatografía de exclusión por tamaño	Facil de manejar	Contaminación de proteínas
	Separación basada en micromatrices	Alta resolución	Obstrucción de pilares de rendimiento limitado
	Separación activa en microcanal	Alta tasa de recuperación	Daño estructural potencial interferencia analógica
Efecto de inmunoafinidad	Separación de anticuerpos	alta especificidad	Alto costo
Separación de aptámeros	Fácil escalado alta especificidad	Facilidad de degradación
estrategia múltiple	Chips de microfluidos integrados	Ahorro de tiempo de automatización	Proceso de diseño complejo Fabricación sofisticada

2.1 Métodos basados ​​en propiedades físicas para recolectar exosomas totales

2.1.1 Métodos tradicionales basados ​​en la densidad de exosomas

El método más clásico utilizado actualmente es el método de centrifugación diferencial seguido de ultracentrifugación, que se refiere a la separación de los componentes necesarios en la mezcla bajo una serie de condiciones de aceleración centrífuga que aumentan gradualmente y la eliminación de otros componentes innecesarios. El principio básico es que la densidad de las sustancias en una solución mixta varía según su forma, tamaño y masa. Generalmente, diferentes densidades implican diferentes velocidades de sedimentación bajo el efecto de la fuerza centrífuga. Por lo tanto, las sustancias se pueden separar gradualmente mediante el uso de una serie de centrifugaciones. En la práctica separación de exosomas ( Figura 2A ), centrifugación a baja velocidad (300–2000 × g, 20 min) se emplea primero para eliminar células y células muertas en la muestra biológica. Luego, los desechos celulares se precipitan bajo centrifugación a 10 000 durante 10 min. Después de eso, se introduce la centrifugación a una velocidad más alta (100 000 × g , 90 min) para obtener vesículas rugosas, que contienen MV, exosomas y agregados de proteínas. Finalmente, esta mezcla se resuspende en PBS y los exosomas rugosos que contienen MV se recolectan después del último paso de centrifugación de alta velocidad (100 000 × g, 90 minutos). El diseño experimental de este método no es complicado y no implica procedimientos sofisticados de procesamiento de muestras, por lo que tiene la ventaja de que se puede ampliar fácilmente y puede manejar muestras con volúmenes de hasta varios cientos de mililitros. Por lo tanto, se ha utilizado ampliamente para el aislamiento de exosomas derivados del cáncer a partir de varias fuentes de muestras líquidas, como sangre, ^[ 31 ] sobrenadante de cultivo celular, ^[ 32 ] y orina. ^[ 33 ] Sin embargo, las deficiencias también son evidentes. Todo el proceso depende en gran medida de un equipo centrífugo engorroso y requiere mucho tiempo y mano de obra. Además, la tasa de recuperación ^[ 34 ] y la pureza^[ 35 ] del producto final obtenido por centrifugación diferencial están limitados porque el producto es una mezcla de MV, exosomas y otros componentes no vesiculares (como cuerpos de apoptosis y algunos agregados de proteínas) que tienen una densidad similar a la de los EV. Este resultado puede comprometer la precisión y la confiabilidad del diagnóstico y la terapia basados ​​en exosomas. ^[ 36 ]

Para aumentar la pureza del método de centrifugación diferencial, los investigadores introdujeron una solución de sacarosa o iodixanol en el último paso de la ultracentrifugación anterior. Este método, llamado centrifugación en gradiente de densidad, consiste en colocar la suspensión de PBS que contiene vesículas rugosas en la capa superior de la solución preparada en gradiente al 5–90 %, y después de un cierto período de centrifugación a alta velocidad (como 100 000 × g , 70 min ^[ 37 ] ), los exosomas rugosos y otras impurezas restantes (como los agregados de proteínas) se pueden distribuir en diferentes regiones de densidad (Figura  1B ). En comparación con el método de centrifugación diferencial, este enfoque ha logrado algunos avances en la pureza de los exosomas. ^[ 38 ]Pero no se puede ignorar que el largo tiempo de procesamiento no solo aumentará el costo total de la separación, sino que también puede afectar el mantenimiento de la morfología y la actividad biológica de los exosomas.

Debido a que estos dos tipos de EV, exosomas y MV se superponen en tamaño y densidad, aunque muestran orígenes diferentes, aún es difícil distinguirlos por completo. ^{[ 39 , 40 ]} Por lo tanto, a pesar de que el método de separación de exosomas basado en la densidad es fácil de usar, adolece de las deficiencias de una pureza limitada y una carga de trabajo engorrosa.

2.1.2 Métodos basados ​​en la solubilidad de los exosomas

Similar a la estructura de las membranas celulares, los exosomas pueden existir de manera estable en soluciones acuosas debido a los extremos hidrófilos de fósforo y las proteínas de membrana en sus superficies. Sin embargo, cuando se introduce un polímero altamente hidrofílico en la solución de exosomas, interactuará con las moléculas de agua que rodean a los exosomas y formará un microambiente hidrofóbico, lo que resultará en una disminución de la solubilidad de los exosomas. Por lo tanto, los exosomas pueden precipitarse en la muestra debido a la falta de moléculas de agua. Sobre la base de este principio, los investigadores agregaron una solución de polietilenglicol a una muestra biológica que se había purificado inicialmente eliminando los restos celulares e incubaron la solución mixta resultante durante la noche a baja temperatura ( Figura 3 ). Después de centrifugar dos veces a baja velocidad (5000 × g), se pueden recolectar los exosomas requeridos. ^[ 41 ] Este método es fácil de operar con un proceso de purificación simplificado, lo que facilita enormemente su popularización y ampliación.

En esta etapa, se han puesto en el mercado en muchos países kits de purificación de exosomas basados ​​en la precipitación de polímeros hidrofílicos, como Total Exosome Isolation Reagent desarrollado por Invitrogen y ExoQuick de System Biosciences de los Estados Unidos, Exosome Isolation Kit de Exiqon de Dinamarca, Exosome Kit de purificación de Norgen Biotek de Canadá y reactivo de aislamiento de exosomas GS desarrollado por Geneseed Biotech de China. ^[ 36 ] Entre ellos, ExoQuick goza de una amplia aceptación y ha desempeñado un papel importante en diversas investigaciones sobre el cáncer, como el cáncer de ovario, ^[ 42 ] el cáncer de mama, ^[ 43 ] el cáncer gástrico, ^[ 44 ] el cáncer de colon, ^[45 ]y cáncer de hígado. ^[ 46 ]Aun así, el método de precipitación todavía tiene algunas deficiencias. Primero, mientras que el polímero reduce la solubilidad de los exosomas, también coprecipita algunos otros agregados de proteínas, de modo que hay un exceso de proteínas en el producto final que no se puede eliminar, como la albúmina y la inmunoglobulina. ^[ 47 ]De lo contrario, vale la pena mencionar que el contenido de ARN (ARNm y miARN) extraído de los exosomas logrado por este método también es significativamente más alto que el de la ultracentrifugación, lo que indica que este método es muy adecuado para la investigación de ácidos nucleicos. ^[ 48 ]Además, excepto la contaminación por proteínas, también existen polímeros residuales en el sistema final de la solución de exosomas aislados y se informa que estas impurezas tienen una citotoxicidad celular inesperada y pueden afectar negativamente el análisis posterior. ^[ 49 ] Por lo tanto, incluso si este método ha sido ampliamente utilizado, todavía se necesita mucho esfuerzo para eliminar las impurezas no deseadas.

2.1.3 Métodos basados ​​en el tamaño de los exosomas

El diámetro de la mayoría de los exosomas es de decenas de nanómetros, que es la base material de los métodos de separación de exosomas basados ​​en el tamaño. El principio de diseño de este método es que cuando la muestra fluye a través de algunos poros, canales o conjuntos construidos, las trayectorias de movimiento de las partículas de tamaño micrométrico (células), las sustancias macromoleculares (ácidos nucleicos y proteínas) y los exosomas tienden a moverse. en diferentes direcciones. Durante el proceso de separación, existen métodos pasivos que se basan únicamente en el campo de gravedad sin fuerza externa y métodos activos mediante la introducción de fuerza externa, como campo eléctrico, de sonido y térmico. En términos generales, el primero es fácil de operar, mientras que requiere mucho tiempo y la pureza es limitada. En comparación, este último requiere un control preciso y un dispositivo sofisticado, pero el aislamiento de los exosomas es bastante eficiente.

Separación de membranas

La filtración por membrana es también un método de separación tradicional, que se refiere al uso de una membrana con estructura microporosa diseñada de un tamaño específico para separar partículas en el líquido según su tamaño. Para la separación de exosomas, se suele utilizar un filtro a escala micrométrica para eliminar células y restos celulares, y se combina un filtro a escala nanométrica para eliminar vesículas grandes y obtener exosomas. El método relativamente popular para la separación de exosomas se denomina modo de filtrado secuencial. ^[ 36 ] Como se muestra en la Figura 4A, la muestra de sangre se pasa primero a través de un filtro de 1000 nm para eliminar algunas partículas grandes, y luego el filtrado se hace fluir a través de un segundo filtro de membrana de ultrafiltración MWCO de 500 kD para eliminar proteínas libres y otras partículas pequeñas. Por último, se aplica un filtro de 200 nm para recolectar exosomas con un diámetro entre 50 y 200 nm. Basado en este método de filtración secuencial fina, Bio Scientific Corporation ha desarrollado y lanzado al mercado un kit de aislamiento de exosomas ExoMir. ^[ 50 ]Comparado con el método de centrifugación diferencial, este método tiene ventajas significativas, que incluyen ahorrar mucho tiempo y evitar la posibilidad de que los exosomas se dañen por la fuerza de corte. Pero también tiene la desventaja de que las muestras líquidas de alta concentración a menudo se obstruyen cuando fluyen a través de la membrana del filtro. El problema de obstrucción de la membrana no solo reducirá la vida útil de la membrana, sino que también afectará la eficiencia de separación. ^[ 51 ]

Para solucionar este problema, se introdujo el flujo tangencial en el sistema de filtración. Significa que el líquido a filtrar se mantiene fluyendo en dirección paralela a la membrana bajo presión constante (generalmente producida por bomba), mientras que las partículas se mueven en dirección tangencial a la membrana. ^[ 52 ] En comparación con la filtración sin salida tradicional, este protocolo de filtración de flujo tangencial (TFF) (Figura  4B ) puede reducir eficazmente la posibilidad de que las células se obstruyan en los poros de la membrana y obtener una alta tasa de recuperación. ^[ 53 ] Al principio, se usaba para la separación de nanopartículas fabricadas, ^[ 54 ]y posteriormente también se ha aplicado para la separación de exosomas en orina. ^[ 55 ]

Recientemente, Han ^[ 56 ] combinó con éxito TFF con tecnología de microfluidos y transfirió el proceso de aislamiento de exosomas mediante filtración a un chip a escala micrométrica ( Figura 5 ). La muestra que ha sido pretratada bajo centrifugación de alta velocidad (10000 × g, 30 min) para eliminar los restos celulares se inyecta en un canal serpenteante con un ancho de 500 µm desde la entrada superior 1. Los exosomas se capturan en una membrana porosa con un tamaño de poro de 100 nm, mientras que las proteínas y algunas partículas pequeñas se eliminan por lavado en la salida 3. Después de enjuagar dos veces con agua desionizada, la entrada 1 y la salida 3 se cierran, y se inyecta agua desionizada desde la entrada inferior 4 para eluir los exosomas a través de la salida 2. Los resultados mostraron que los exosomas de células de cáncer de cuello uterino obtenidos por este son más uniformes en tamaño de partícula que las obtenidas por centrifugación diferencial. Además, cabe señalar que la intensidad de la presión de filtración debe controlarse cuidadosamente, ^[ 57 ] de lo contrario, puede causar daños irreversibles a la morfología completa de los exosomas.

Método de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC)

En el campo del análisis de compuestos, para separar componentes con diferentes pesos o tamaños moleculares, además de la separación por el método de membrana, también se pueden utilizar algunas fases estacionarias estrechamente empaquetadas. Las fases estacionarias suelen ser un material de resina con una estructura porosa o un polímero hidrofílico (como dextrano, agarosa) que pueden formar un gel y se introducen en una columna que permite que fluyan el líquido de muestra y el eluyente. Este sistema se define como SEC, que tiene como objetivo separar los componentes según la diferencia en la distancia de flujo de las partículas. Cuando la muestra fluye a través de la fase estacionaria, las células de gran tamaño no pueden entrar en los poros del material relleno y solo pueden avanzar por el camino alrededor del material estacionario. Por el contrario, los exosomas con forma más pequeña pueden penetrar en los poros y fluir a través de la mayoría de los poros. Por lo tanto, la distancia de movimiento de los exosomas aumenta significativamente y lleva más tiempo eluir los exosomas. Varios componentes en las muestras biológicas se pueden separar de acuerdo con la diferencia en el tiempo de retención de las sustancias que se desplazan en la fase estacionaria (Figura 6 ). SEC también se ha desarrollado rápidamente. En la actualidad, qEV (iZON) y PURE-EV ya están disponibles en el mercado, y las columnas mini-SEC se utilizan para separar exosomas derivados del cáncer en laboratorios de todo el mundo. Hong ^[ 58 ] obtuvo exosomas con estructura completa y excelente actividad funcional a partir de muestras de plasma de pacientes con leucemia mieloide aguda y carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC) en 30 minutos mediante el uso de mini-SEC, y señaló que estas ventajas eran de gran importancia del análisis aguas abajo. Luis ^[ 59 ]condiciones de cultivo celular in vitro optimizadas de forma creativa mediante el uso de la información de recuperación y pureza de los exosomas obtenidos por mini-SEC. Aún así, este método todavía reporta que puede haber algunos problemas de contaminación de proteínas, debido a que los exosomas obtenidos por SEC mostraron un mayor ancho de distribución en un rango de diámetro pequeño. Por lo tanto, algunos académicos han propuesto estrategias modificadas combinadas con el método de membrana de ultrafiltración para eliminar el exceso de impurezas, lo que puede mantener la integridad funcional de los exosomas y mejorar la pureza. ^[ 60 ]

Separación basada en micromatrices

Inspirándose en las diferentes trayectorias de las partículas en SEC, los investigadores propusieron posteriormente algunas estructuras emergentes basadas en micromatrices para la separación de exosomas. Generalmente, las partículas con diferentes tamaños mostrarán diferentes trayectorias en el dispositivo de microarray especialmente diseñado. Algunas partículas se moverán hacia adelante en un patrón en zigzag cuando fluyan en una matriz paralela especialmente diseñada, mientras que otras saldrán de la matriz en forma de golpe. Esta diferencia se denomina desplazamiento lateral determinista (DLD). ^[ 61 ] Como puede verse en la Figura 7, los micropilares idénticos están dispuestos en paralelo, pero los micropilares de cada columna están desplazados de la fila anterior por una distancia regular en la fila siguiente. En condiciones prácticas, después de que la muestra ingresa a la matriz, las partículas pequeñas seguirán la línea de corriente inicial y se moverán en una trayectoria en zigzag, mientras que las partículas grandes chocarán con los pilares y se moverán lateralmente a la siguiente línea de corriente como un modo de choque hasta que fluyan fuera de la matriz. área de matriz. El parámetro de tamaño de corte de los dos modos de movimiento se llama diámetro crítico DLD D _c , y este valor está asociado por la geometría de la matriz, que se ve afectada por algunos parámetros importantes, la brecha del pilar G , el paso del pilar λ y el ángulo entre la primera fila y la última fila de micropilares θ _max. De acuerdo con este principio, Smith ^[ 62 ] informó sobre un chip nanoDLD y lo aplicó con éxito en la separación y el enriquecimiento de exosomas en suero y orina, y demostró que este método puede aumentar en aproximadamente un 50 % sobre la base de la centrifugación diferencial y la SEC cuando se usa el mismo pequeño volumen de muestra. Además, después de inyectar suero del paciente con cáncer de próstata en este sistema, la secuenciación del ácido nucleico del producto aislado también verificó la capacidad del ácido nucleico para caracterizar la agresividad del cáncer de próstata.

Separación Activa en Microcanal

El método de membrana, SEC y DLD se basan en la diferencia en las trayectorias de las partículas, para lo cual es necesario construir varias barreras en el dispositivo, como canales porosos y micromatrices. Por lo tanto, estos enfoques pueden considerarse estrategias pasivas, ya que dependen en gran medida de la naturaleza de los propios exosomas. En los últimos años, se ha demostrado que las fuerzas desiguales ejercidas sobre las partículas biológicas en el campo físico también pueden dar lugar a movimientos desviados de las partículas, lo que da lugar a muchos métodos de separación nuevos. En términos de separación de exosomas, existen tres campos de fuerza externos comúnmente utilizados, a saber, dielectroforesis (DEP), radiación acústica y fuerza centrífuga. Los principios y aplicaciones involucrados en estas tres fuerzas se explicarán a continuación.

La fuerza DEP es un tipo de fuerza que permite que las partículas polarizadas en un campo eléctrico no uniforme realicen una migración direccional. El valor de la fuerza DEP depende del tamaño de las partículas suspendidas y está relacionado con las propiedades eléctricas de los medios. En general, al aplicar voltaje alterno en un microelectrodo en solución, se puede crear el fenómeno DEP y, por lo tanto, se aplica la fuerza DEP en la manipulación de micro y nanopartículas. Ibsen ^[ 63 ] propuso un chip de micromatriz eléctrica basado en la tecnología DEP, que puede separar y recuperar rápidamente el exosoma del glioblastoma a partir de muestras de sangre sin diluir ( Figura 8A). El principio de separación del chip es que, de acuerdo con las diferentes propiedades dieléctricas de los exosomas y otros componentes del plasma, los exosomas son atraídos hacia la región del borde del microelectrodo, es decir, la región de campo fuerte de la electroforesis dieléctrica, mientras que las células y las proteínas macromoleculares son atraídas. en el campo débil de la electroforesis. Además, Sonnenberg ^[ 64 ] separó con éxito el ADN y otras sustancias a nanoescala de la sangre mediante métodos similares de electrodos de micromatrices. Al usar este método, la recuperación y la pureza del exosoma fueron altas y los volúmenes de muestra de plasma requeridos fueron pequeños. Sin embargo, una de las desventajas potenciales de este método es que el exosoma puede dañarse por fenómenos electroquímicos resultantes del contacto directo entre el exosoma y el electrodo.

Al combinar hábilmente la tecnología de microfluidos y la acústica para formar un fluido acústico (Acoustofluidics), los investigadores pueden realizar de manera efectiva la clasificación y manipulación de partículas. El principio es que las partículas de diferentes tamaños están sujetas a una fuerza de radiación acústica diferencial y una fuerza viscosa en el campo de sonido microfluídico. La fuerza viscosa es proporcional al radio de la partícula, mientras que la fuerza de radiación acústica es proporcional al volumen de la partícula. Para partículas más grandes, la fuerza de radiación acústica juega un papel dominante y las partículas se mueven hacia el nodo acústico; mientras que para las partículas más pequeñas, la fuerza viscosa contrarresta la mayor parte de la fuerza de radiación acústica y el movimiento lateral de las partículas es débil. Bajo la acción combinada de la fuerza de radiación acústica y la fuerza viscosa, las partículas de diferentes tamaños se moverán a diferentes salidas, y luego se realizará la separación de partículas. Aunque la tecnología acustofluídica se usa ampliamente en la manipulación y el aislamiento de células, el dispositivo acústico fluídico original solo es adecuado para la separación de dos tipos de partículas presentes en el sistema. Por lo tanto, es difícil separar los exosomas de la sangre compleja. En respuesta a esta deficiencia, Wu^[ 65 ] desarrolló un nuevo tipo de dispositivo de fluido acústico, en el que los exosomas se pueden separar de forma rápida y eficaz de las muestras de sangre entera sin etiquetado ni contacto. Como se muestra en la figura  8B , el dispositivo se divide en un módulo de eliminación de microcelulares y un módulo de separación de exosomas. En primer lugar, se utiliza una onda acústica de menor frecuencia (19,6 MHz) en el módulo de eliminación microcelular para eliminar los glóbulos rojos, los glóbulos blancos y las plaquetas más grandes; Se utiliza una onda de sonido de mayor frecuencia (39,4 MHz) en el módulo de aislamiento de exosomas para separar el exosoma de los componentes de los EV (cuerpos apoptóticos, EV más grandes, etc.). Lee ^[ 66 ]también demostró un método de separación de exosomas basado en un sistema de nanofiltración acústica. El método se basa en las diferencias en el tamaño y la densidad de los vehículos eléctricos y otros componentes. Las vesículas a nanoescala (<200 nm) se pueden aislar del medio de cultivo celular y los productos de eritrocitos mediante onda estacionaria ultrasónica. El método de separación de exosomas basado en fluido acústico tiene las ventajas de buenas características biológicas, buena pureza y tasa de recuperación satisfactoria. Es un método de separación novedoso. Sin embargo, el principio de separación se basa en el tamaño de los objetos y las características de impedancia acústica, por lo que es inevitable ser perturbado por otros componentes en el plasma que son similares al exosoma en tamaño y características de impedancia acústica.

Las plataformas centrífugas de microfluidos proporcionan otro modo de separación al integrar una red de multiplexación de microcanales y cámaras en plataformas de forma circular o discos compactos (CD), y se han utilizado ampliamente para realizar una separación celular económica, desechable y de alto rendimiento. que son fáciles de manejar y no necesitan equipos sofisticados. ^[ 67 ] En la plataforma microfluídica centrífuga, el flujo/plasma será activado por la fuerza centrífuga, y la magnitud de la aceleración centrífuga es muy grande. Por ejemplo, a la velocidad de 2000 r min – ¹ y el radio centrífugo de 20 mm, la aceleración centrífuga puede llegar a 876,4 ms- ² , que es aproximadamente 89 veces la aceleración de la gravedad. ^[ 68] Tal fuerza y ​​aceleración tan grandes facilitan el movimiento de las células sanguíneas u otras partículas hacia el fondo de una cámara en el disco centrífugo, logrando efectivamente el objetivo de la eliminación de células. Cabe mencionar que la aplicación de esta plataforma ha impulsado con éxito el desarrollo de métodos de separación de CTCs. ^[ 69 ] En aplicaciones prácticas, la separación celular en un chip microfluídico centrífugo sirve como plataforma para el pretratamiento de la sangre para la separación de exosomas. El papel de este método es principalmente eliminar células de muestras biológicas complejas, pero debe combinarse con otras estrategias para obtener exosomas con alta pureza o especificidad.

Otros enfoques de separación

En la microfluídica viscoelástica, una fuerza viscoelástica puede actuar sobre una partícula y hacer que se mueva en una dirección diferente. La magnitud de la fuerza viscoelástica y su desplazamiento está relacionada con el tamaño de la partícula. A diferencia de otras técnicas como fluido acústico y DEP, la separación viscoelástica puede manipular con precisión partículas sin fuerza de campo adicional mediante el método de separación viscoelástica microfluídica. Por lo tanto, la fuerza viscoelástica de la microfluídica se puede utilizar como una técnica simple y sin etiquetas para la manipulación y separación de partículas. Liu ^[ 70 ] propuso un método que utiliza polímeros de óxido de polietileno (polioxietileno, PEO) como aditivo medio para cambiar la viscoelasticidad del fluido. Como se muestra en la Figura 9A, en el proceso de separación, el control del caudal de la entrada y la vaina hace que la muestra arranque por ambos lados del microcanal. Los EV más grandes se mueven hacia el centro del canal por una fuerza viscoelástica más grande, mientras que el exosoma más pequeño tiene una viscoelasticidad limitada y menos desplazamiento. Al final del canal, los exosomas y los vehículos eléctricos más grandes pueden moverse hacia diferentes salidas.

De manera similar a la plataforma de microfluidos centrífugos, existe otra estrategia de preprocesamiento de muestras que se utiliza para la separación de exosomas, a saber, los microfluidos de inercia en el anillo espiral. De acuerdo con el principio de la microfluídica inercial, el estado de flujo de las partículas en el canal espiral está determinado por la magnitud relativa de la fuerza de sustentación inercial F _L y la fuerza de arrastre de Dean F _D. La relación de las dos fuerzas está estrechamente relacionada con el radio de curvatura y el diámetro hidráulico del canal y el tamaño de las partículas. Cuando domina la fuerza de elevación inercial, puede empujar partículas de escala micrométrica que se mueven rápidamente a la posición de equilibrio y forman un flujo de foco inercial. Por lo tanto, mediante el diseño de un anillo en espiral con parámetros específicos, las células de la muestra se pueden filtrar y se puede evitar el proceso centrífugo con daño por cizallamiento. Zhou ^[ 28 ] diseñó un dispositivo en espiral de seis bucles en un chip para separar las células sanguíneas de la sangre total de pacientes con cáncer de ovario y envió el producto al módulo posterior de captura específica de exosomas (Figura  9B). Este anillo en espiral tiene una longitud total de 23 cm, un ancho de 500 µm y una altura de 50 µm, que puede lograr una eficiencia de separación de casi el 100 % para sangre con un hematocrito de 0,5 % y 1 %.

2.2 Métodos basados ​​en las características biológicas de los exosomas

Las estrategias discutidas anteriormente se basan en las propiedades físicas de los exosomas, como su densidad, tamaño y solubilidad, que pueden sufrir interferencias analógicas o impurezas contaminantes. Para superar esta deficiencia, se propuso otro método simple pero poderoso de separación de exosomas basado en la inmunoafinidad biológica. Utilizaron perlas magnéticas recubiertas de anticuerpos monoclonales para aislar específicamente sus correspondientes anticuerpos expresados ​​en la superficie de los exosomas. ^[ 71 ]Estas perlas pueden capturar con eficacia los exosomas diana y permitir su análisis posterior, como la citometría de flujo y la transferencia Western. Teóricamente, cualquier proteína o componente de la membrana celular que exista solo o en gran parte de la membrana de los exosomas sin una contraparte soluble en el líquido extracelular puede usarse para la captura de exosomas en función de la inmunoafinidad. En las últimas décadas, se han registrado varios marcadores de exosomas, incluida la proteína de membrana 2B asociada a lisosomas, proteínas transmembrana, proteínas de choque térmico, receptores de factores de crecimiento derivados de plaquetas, proteínas de fusión (como Lorraine, Anexina y GTPasas), lípidos proteínas relacionadas y fosfolipasas. Entre ellas, las proteínas transmembrana como Rab5, CD81, CD63, CD9 y CD82 se han utilizado ampliamente para la separación selectiva de exosomas ^{[ 72 ]., 73 ]} y se han producido varios productos populares de separación de exosomas, incluido el kit de análisis y separación de exosomas (Abcam), el reactivo de aislamiento de exosomas-humanos CD63 (Thermo Fisher Scientific) y el kit de aislamiento de exosomas CD81/CD63 (Miltenyi Biotec). ^[ 74 ] Debido a la ubicuidad de las proteínas transmembrana, los exosomas obtenidos a partir de dichos anticuerpos son la suma de los distintos tipos de exosomas de las especies de muestras biológicas. El diagrama esquemático de exosomas totales de separación se mostró en la Figura 10A . Matsuda ^[ 75 ]aplicó los kits de aislamiento CD9, CD63 y CD81 de Thermo Fisher Scientific para separar exosomas del líquido de cultivo de células de cáncer de páncreas y obtuvo tres tipos diferentes de solución de exosomas con las proteínas transmembrana correspondientes (exosomas positivos para CD9, CD63 y CD81) (Figura  10B ). Luego, los productos se sometieron a análisis de matriz de lectina y los datos de resultados se presentaron mediante análisis de componentes principales, que mostraron que los tres tipos de exosomas se distinguieron con éxito en función de las diferencias en la expresión glucómica en la superficie (Figura  10C ).

Cuando intentamos adquirir un tipo de exosoma particular asociado a una enfermedad, debemos emplear anticuerpos específicos para capturarlos. En la superficie de los exosomas, se puede detectar una amplia gama de diferentes antígenos derivados del cáncer, como CEA, EpCAM, HER2, IGFR, LMP1, MUC18 y PSMA. Están altamente correlacionados con los tipos de células huésped y se usan comúnmente como indicadores diagnósticos y terapéuticos para una variedad de cánceres. Los biomarcadores de exosomas notificados que se han utilizado se resumen en la Tabla 2 . Zhao ^[ 76 ]combinó tres tipos de cuentas magnéticas conjugadas con biomarcadores, incluidos los anticuerpos CD24, EpCAM y CA125, para diferenciar pacientes con cáncer de ovario y grupos sanos. Los resultados mostraron que el contenido de CD24, EpCAM y CA125 de la sangre de los pacientes aumentó 3, 6,5 y 12,4 veces, respectivamente, lo que demostró el gran potencial de los marcadores biológicos en la separación de exosomas y el análisis del cáncer. Además, Wang ^[ 27 ]diseñó un chip de detección y separación de exosomas. Las perlas magnéticas inmovilizadas con el anticuerpo anti-CD63 se usaron para capturar los exosomas en la orina de pacientes con cáncer de próstata, y las moléculas señalizadoras Raman adicionales permiten que los exosomas capturados muestren señales Raman y sean detectados. Vale la pena señalar que, para permitir que los exosomas entren en contacto completo con las perlas magnéticas y aumenten la eficiencia de captura, se introdujo en el sistema una disposición ordenada de estructura de micropilar triangular. El principio del micromezclador es que el fluido que fluye a través de él crea un flujo anisotrópico en el que las sustancias se mezclan y dispersan constantemente, lo que finalmente da como resultado una distribución uniforme. El diseño de este chip proporciona una referencia para mejorar la eficiencia de la captura biológica de exosomas.Tabla 2. Marcadores utilizados para el aislamiento de exosomas derivados del cáncer

tipo de cáncer	Antígeno	Árbitro.
Cáncer de ovarios	CA19-9, CA125, CD24, CD171, CLDN3, MUC18	[ 77 – 79 ]
Cáncer de mama	CD44, CEA, E-cadherina, EGFR, HER2, IGFR, MIF	[ 80 – 83 ]
Cäncer de próstata	CD41b, E-cadherina, IGER, PSMA	[ 81 , 82 ]
Cáncer de pulmón	CEA, EGFR, IGFR	[ 81 , 84 ]
Cáncer de colon	CD44, EpCAM, FAM1348, IGER	[ 80 , 85 , 86 ]
Cancer de pancreas	GPC1, FOMIN	[ 83 ]

Aunque el aislamiento de anticuerpos tiene ventajas obvias, su alto costo y carácter perecedero han dificultado sus aplicaciones, especialmente en la preparación de exosomas a gran escala. Sobre la base de esta estrategia, otra secuencia de nucleótidos sintetizada químicamente, el aptámero, se empleó posteriormente y ampliamente. Por un lado, puede unirse a moléculas diana específicas para capturar exosomas, como proteínas transmembrana y marcadores de cáncer. Por otro lado, su proceso de síntesis muestra una baja variación de lote a lote y una fácil ampliación. ^–[ 87 ] Por lo general, el aptámero se conjuga en perlas magnéticas mediante un conector de estreptavidina-biotina para capturar exosomas ( Figura 11 ). ^[ 88 ]Bajo el efecto del campo magnético externo, se acumulan perlas cargadas de exosomas. Después de eso, los exosomas pueden liberarse de forma no destructiva mediante la adición de una secuencia complementaria competitiva de aptámero debido a su cambio de estructura. El fenómeno de liberación también se puede realizar modificando el sistema tampón y los iones de la solución (p. ej., Mg ²⁺ y K ²⁺ ). ^[ 89 ] Liu ^[ 90 ]informó un aptasensor termoforético (TSA) basado en la diferencia en el rendimiento termoforético de partículas con diferentes tamaños en el campo térmico para capturar exosomas. Los autores crearon un campo térmico y enriquecieron con éxito los vehículos eléctricos a altas temperaturas. Posteriormente, estos productos han demostrado ser confiables para clasificar el cáncer y distinguir enfermedades malignas y benignas. También es importante tener en cuenta que los aptámeros deben almacenarse y usarse con mucho cuidado porque son vulnerables a la degradación de las enzimas.

2.3 Multiestrategia innovadora para la separación de exosomas

Cuando se utiliza tecnología de separación basada en el principio de inmunoafinidad, para evitar que las células sean reconocidas y reducir la tasa de captura de exosomas, las muestras biológicas generalmente se procesan previamente para formar una muestra libre de células. De acuerdo con lo mencionado anteriormente, estos preprocesamientos se pueden realizar mediante métodos de eliminación de partículas tales como centrifugación, filtración y microfluidos inerciales. Por lo tanto, para obtener de manera eficiente productos de alta pureza, la combinación de múltiples métodos para separar exosomas es la tendencia de desarrollo futuro en este campo. Estas estrategias innovadoras se reflejan principalmente en dos aspectos. Una es transferir el método macroscópico al sistema microfluídico y manipular con precisión partículas en la escala micrométrica, lo que puede reducir la participación de instrumentos grandes, como ultracentrífugas, y mejorar la eficiencia de separación de muestras con poco volumen. El segundo es combinar múltiples estrategias para obtener exosomas con alta pureza o especificidad para presentar con precisión la información de la enfermedad. De acuerdo con estas ideas, se propusieron con éxito algunos chips de separación de exosomas basados ​​en estrategias múltiples.

Por ejemplo, se ha informado sobre un dispositivo Exodisc para separar exosomas de sangre en un disco totalmente automático mediante la combinación de estrategias de centrifugación y filtración. ^[ 91 ] En el chip de microfluidos se distribuyeron un módulo de separación de sangre, dos áreas de funciones de filtrado y tres cámaras de almacenamiento de líquidos (líquido de lavado, desechos y producto) ( Figura 12A). La eliminación de células sanguíneas y la transferencia de líquido se realizaron mediante centrifugación activa, y la eliminación de impurezas se realizó mediante filtración de flujo secuencial. Cabe señalar que el módulo de filtración utilizó el principio de filtración de flujo tangencial para hacer que la dirección del flujo de líquido fuera perpendicular al plano de la membrana, lo que resolvió de manera efectiva el problema del bloqueo de la membrana y evitó la aparición de torta de filtración. Este dispositivo se usó para monitorear la progresión del tumor dentro de las 13 semanas de modelos de xenoinjerto de ratón vivo. Los resultados mostraron que la expresión de CD9, PSA, PSMA, EGFR y otras proteínas aumentó con el aumento del volumen del tumor. Además, los exosomas aislados se analizaron cuantitativamente en busca de proteínas específicas del cáncer de próstata PSA, PSMA. Los datos mostraron que puede distinguir efectivamente a los pacientes con cáncer de los pacientes sanos. Además, se informó sobre un sistema para capturar selectivamente exosomas derivados de carcinoma de células no pequeñas (CPCNP) en un biochip inmunológico.^[ 92 ] Los autores fabricaron una capa de Au de 15 nm mediante evaporación con haz de electrones para albergar dos tipos de proteínas distintivas, anti-PD-L1 y anti-EGFR, con la ayuda del enlazador biotina-avidina (Figura  12B ). Los anticuerpos pueden capturar específicamente los exosomas derivados de tumores y los lipoplexos catiónicos introducidos que contienen balizas moleculares de detección de objetivos de ARN (CLP-MB) permitieron detectar el ARN exosómico bajo microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF). En esta plataforma, el tiempo de separación de exosomas y cuantificación de ARN se redujo a 4 h, y la cantidad de muestra (30 µl) se redujo a 1/3, en comparación con la separación de perlas magnéticas convencional junto con la determinación de PCR. dong ^[ 93 ]también desarrolló un chip novedoso para separar los EV derivados del sarcoma de Ewing (ES), que se denominó ES-EV Click Chip (Figura  12C). En este chip, se fabricaron dos marcos de soporte, una placa base llena de sustratos de nanocables de silicio (SiNWS) para aumentar el área de superficie del dispositivo y un canal serpenteante que utiliza PDMS (polidimetilsiloxano) que permite un mayor contacto físico entre los nanocables y la solución de exosomas. El aislamiento de los exosomas en este chip se realizó mediante el efecto de inmunoafinidad de una proteína LINGO-1, especialmente expresada en vesículas derivadas de ES, con su contraparte. Sin embargo, el posterior enriquecimiento de exosomas se preparó mediante la ruptura del conector entre anti-LINGO-1 y SiNWS. El enlazador se sintetizó mediante química clic utilizando transcicloocteno (TCO) y tetrazina (Tz). Este estudio integró el conocimiento químico para desarrollar nuevas vías de captura y liberación de exosomas, y diseñó diferentes microestructuras para una mejor eficiencia de aislamiento.

La introducción de la tecnología de microfluidos ha transferido experimentos complejos a chips de tamaño micro, haciendo que el proceso de separación de exosomas sea más preciso y controlable, y también propicio para el mantenimiento de la morfología y función de los exosomas. Sin embargo, el diseño de chips de microfluidos requiere esfuerzos sustanciales para explorar los parámetros óptimos, como el número de micropilares y el tamaño del canal (largo, ancho, alto). Además, el proceso de fabricación de chips de microfluidos depende en gran medida de laboratorios costosos e instrumentos extremadamente sofisticados. Por lo tanto, el desarrollo de la tecnología de microfluidos para la separación de exosomas requiere investigaciones más profundas y una integración multidisciplinaria de la biomedicina y la física.

3 Conclusiones

El cáncer ha representado una gran amenaza para la salud humana. La biopsia líquida puede facilitar el seguimiento del pronóstico del cáncer y ha jugado un papel importante en la detección del cáncer en una etapa más temprana a través de una forma más confiable. Como un nuevo objetivo de la biopsia líquida en los últimos años, se ha demostrado que los exosomas derivados del cáncer desempeñan un papel fundamental en el diagnóstico temprano y el seguimiento posterior al tratamiento de una variedad de cánceres. Sin embargo, debido al tamaño pequeño y al entorno de vida complejo de los exosomas, es bastante difícil realizar una separación de alta eficiencia y una detección cuantitativa precisa.

La separación de exosomas derivados del cáncer se ha mejorado durante la última década, y la introducción de plataformas de microfluidos ha acortado considerablemente el tamaño de la muestra y ha ahorrado el tiempo de operación necesario para la separación de exosomas, lo que es adecuado para la detección en tiempo real actual y la medicina de precisión futura. Por lo tanto, el innovador enfoque de microfluidos supera a los métodos tradicionales. Se puede prever que se convertirá en una tendencia de investigación líder para explorar profundamente la combinación de tecnología de microfluidos con múltiples estrategias de separación para desarrollar microsistemas integrados para la separación rápida de exosomas con alta estabilidad y sensibilidad, lo que finalmente permitirá una operación fácil y efectiva para el diagnóstico precoz y tratamiento del cáncer.

Es un cambio de paradigma y un cambio repentino, radical o completo La Revolución de la Salud Inteligente proporcionará a los profesionales de la salud las herramientas que necesitan para personalizar la atención, cambiando el enfoque al paciente, no a la enfermedad.

La gente inteligente de McKinsey & Company predice que experimentaremos más progreso tecnológico en la próxima década que en los últimos 100 años. Imaginemos ese crecimiento rápido del conocimiento y tenemos que estar preparado, junto con un gran grupo de colegas.

Coloquemos la mente y la mirada en cualquiera de estas atracciones tecnológicas emergentes y es probable que encuentre que la IA impulsa las cosas hacia adelante. Los primeros disparos en la Revolución de Inteligencia ocurrieron hace años. Te beneficias de ellos cada vez que te conectas, usas una aplicación inteligente u obtienes instrucciones. La pandemia nos mostró que los humanos son mejores y más rápidos en la resolución de grandes problemas en salud y medicina debido a ellos.

A un alto nivel, la Revolución de la Inteligencia es un ejemplo de lo que los economistas e historiadores que estudian el progreso científico y técnico llaman cambio que se produce debido a una nueva tecnología de propósito general.

Una tecnología de propósito general es aquella que tiene el poder de transformarse continuamente, ramificándose progresivamente e impulsando la productividad y el cambio sistémico en todos los sectores e industrias.

A medida que esto sucede, una tecnología de propósito general altera drásticamente las sociedades a través de su impacto en las estructuras económicas y sociales preexistentes. Los avances científicos y técnicos cambian con frecuencia la historia. La transformación sistémica provocada por una tecnología de propósito general es rara, pero está ocurriendo.

Piense en la máquina de vapor, el generador de electricidad y la imprenta. Usemos la máquina de vapor para ilustrar este punto. Originalmente fue diseñado para bombear agua de las minas. Con el tiempo otros adoptaron y adaptaron esta nueva tecnología. Esto dio lugar a los ferrocarriles, la industria del transporte y la fabricación de producción en masa. A medida que esto ocurría, los beneficios comenzaron a acumularse para todos los sectores. Los agricultores, por ejemplo, adaptaron y utilizaron la máquina de vapor para la energía mecánica, lo que aumentó la producción y mejoró los rendimientos de los cultivos. A medida que crecía la producción agrícola, ahora también tenían una red de transporte para entregar sus productos desde el interior del país hasta las costas, facilitando el comercio con nuevos mercados.

Al igual que la historia de la máquina de vapor, la Revolución de la Inteligencia producirá un cambio exponencial basado en la creciente sofisticación de la IA, el almacenamiento de datos virtualmente gratuito y las comunicaciones que se combinan con poderes computacionales cada vez mayores que ahora rivalizan con algunas capacidades humanas.

Con lo anterior en mente, aplicaremos las siguientes definiciones al contenido y discurso: La Inteligencia Artificial (IA) es una tecnología de propósito general. En pocas palabras, es cualquier sistema que pueda representar o imitar las funciones cerebrales humanas.

La Revolución de la Inteligencia es el cambio generalizado que tiene lugar como resultado del uso de la IA como una tecnología de propósito general que se está aplicando en todas las industrias.

La Revolución de la Salud Inteligente es un término utilizado para caracterizar el cambio generalizado que tiene lugar ahora y en el futuro que proviene de la aplicación de la IA en los campos de la salud y la medicina.

Un sistema de salud inteligente es una entidad que adopta la Revolución de la Salud Inteligente al aprovechar los datos y la IA para crear ventajas estratégicas en la prestación de servicios médicos y de salud en todos los puntos de contacto, experiencias y canales. A diferencia de los sistemas de salud tradicionales, los sistemas de salud inteligentes utilizan la IA para impulsar nuevos enfoques para superar los antiguos desafíos de mejorar el acceso, la calidad, la eficacia y los costos de los servicios de salud. Lo hacen siendo más rápidos y mejores que las organizaciones similares pero tradicionales mediante el uso de tecnologías que permiten la IA, conectividad ubicua y dispositivos y sistemas inteligentes.

Un matiz importante de estas definiciones es que la IA permite a los humanos cambiar la forma en que viven y trabajan. Depende de los humanos adoptar tecnologías de IA. Al hacerlo, también deben estar dispuestos a adaptarse a los cambios provocados por la IA.

Finalmente, mientras definimos términos, veamos la frase de salud digital que se usa a menudo. La Healthcare Information and Management Systems Society (HIMSS) es una asociación miembro global comprometida con la transformación del ecosistema de la salud. En una revisión exhaustiva de la transformación de la atención médica, HIMSS llama la atención sobre el problema que rodea el uso de este término: «salud digital» se ha discutido ampliamente, sin embargo, una definición acordada de salud digital sigue siendo difícil de alcanzar.

Una variedad de términos y conceptos se utilizan indistintamente en referencia a la salud digital, incluyendo «mHealth» (salud móvil), «eHealth» (por ejemplo, tecnología y aplicaciones digitales para ayudar a los pacientes en su salud), atención virtual y telesalud, por nombrar solo algunos.  Si bien nadie tiene una bola de cristal perfecta en cómo se desarrollará la transformación, aquí hay tres tendencias que la IA y la Revolución de la Salud Inteligente seguramente impulsarán. De reactivo a proactivo Los sistemas de salud tradicionales de hoy en día son principalmente reactivos.

Están surgiendo Sistemas de Salud Inteligentes que son proactivos. Considera algo tan básico como el «examen anual». Uno de cada cinco adultos en los Estados Unidos se hace un examen físico anual en el consultorio de un médico. En esta visita cara a cara, un médico recopila datos utilizando un estetoscopio junto con pruebas de laboratorio para proporcionar una instantánea del estado de salud de un paciente en ese momento. Al hacerlo, es realmente una «mirada retrospectiva» a cómo su cuerpo y su salud han cambiado desde la última vez que se sometió a su chequeo anual.

Si esta «mirada retrospectiva» concluye que tiene una afección médica, se le dice que deje de fumar, comience a comer sano, reduzca su consumo de alcohol, tome un nuevo régimen de medicamentos, se someta a un procedimiento médico correctivo o una serie de otras cosas que están reaccionando a un problema médico que ahora tiene. Al igual que muchos otros aspectos de cómo funcionan los sistemas de salud tradicionales, los exámenes anuales son la norma basada en el pensamiento antiguo y las capacidades pasadas. Gran parte de ella nos mantiene en el ámbito de la atención médica reactiva.

En el mundo de la salud inteligente, consideremos un enfoque que se convierta proactivamente en un «examen perpetuo». Su médico todavía está activamente comprometido. Pero en lugar de reunirse en una ubicación física (consultorio médico) en puntos designados en el tiempo (anualmente) para esencialmente mirar en el espejo retrovisor, una serie de aplicaciones inteligentes conectadas ayudan a monitorear, analizar, detectar e incluso predecir eventos futuros antes de que sucedan. Esto se hace de forma continua y en tiempo real.

Las organizaciones innovadoras, incluidas la Clínica Mayo, la Universidad de California en San Francisco y Geisinger, están trabajando para transformar digitalmente la visita física tradicional anual en una relación virtual continua.

Con las nuevas innovaciones digitales, lo físico se convertirá en un proceso dinámico, proactivo y continuo. Esto incluye que los médicos tengan la capacidad de proporcionar informes electrónicos continuos y «empujones» para alentar a los consumidores a asumir un papel más activo en la gestión de su salud. Hoy, esto está sucediendo con dispositivos inteligentes que son externos o portátiles. En el futuro, los sensores inteligentes pueden estar incrustados debajo de la piel, tragarse con el desayuno o permanecer nadando en el torrente sanguíneo. Controlarán constantemente su ritmo cardíaco, respiración, temperatura, secreciones de la piel y más. ¿Suena un poco demasiado sci-fi? Empresas como Medtronic ya han sido pioneras en marcapasos y otros dispositivos cardíacos implantables inteligentes que se conectan al dispositivo móvil de un paciente. En una situación, un paciente con un implante cardíaco conectado se sintió mareado mientras cortaba el césped con su teléfono en el bolsillo. En el tiempo que tardó en entrar en la casa y sentarse, su teléfono estaba sonando. Era su vocación clínica. Su dispositivo implantado ya había alertado a un equipo médico y enviado datos relacionados con el problema. Esto les permitió evaluar y actuar en tiempo real.6

La investigación sugiere que los pacientes con implantes inteligentes como este tienen tasas de supervivencia general más altas, menos visitas a la sala de emergencias y estadías hospitalarias más cortas.

Más allá del monitoreo proactivo y el manejo de afecciones físicas como las enfermedades crónicas, la IA está abordando una creciente variedad de problemas de salud mental. Empresas como Kintsugi están utilizando la IA para desarrollar soluciones de biomarcadores de voz que predicen y evalúan cosas como la depresión clínica y la ansiedad.

Lo hacen analizando fragmentos de habla de forma libre. Hay una gran cantidad de información sobre nuestra salud codificada en nuestro discurso. Al aplicar la IA al reconocimiento de voz, se están creando soluciones que pueden ampliar y mejorar las plataformas de telesalud y las aplicaciones de monitoreo de pacientes.10

Los consumidores esperan cada vez más desempeñar un papel más importante en su atención y salud. El cambio a servicios proactivos mejorará el estado de salud general.

La IA también ayudará a que la atención médica sea más proactiva al eliminar las barreras tradicionales y mejorar el acceso para más ciudadanos.

El enfoque predominante de los «sistemas de salud» hoy en día es el manejo de las condiciones médicas a medida que surgen o después de que surjan.

Los sistemas de salud inteligentes nos moverán hacia «sistemas de salud» que se centren en el uso de nuestra sabiduría y tecnología para capacitar a los ciudadanos para vivir vidas más saludables y optimizadas que, en última instancia, puede evitar que ocurran afecciones médicas como la diabetes tipo 2 en primer lugar y piensen en eso por un momento. Imagine un momento en el futuro en el que muy pocas personas mueran prematuramente de enfermedades prevenibles. Hoy en día, 30 millones de personas mueren cada año por afecciones que son reversibles si se detectan a tiempo.

Las afecciones cardiovasculares, la diabetes y el trastorno pulmonar obstructivo crónico (EPOC) son las tres principales afecciones crónicas prevenibles y manejables en los Estados Unidos. Más allá de la pérdida prematura de vidas, estas condiciones por sí solas tienen una carga económica combinada de $ 590 mil millones al año.

La pandemia destacó la necesidad de que el sistema de salud se centre en la salud integral de las personas. Esto significa abordar las vulnerabilidades conductuales, sociales y económicas.

El consumismo de salud inteligente está emergiendo rápidamente a medida que las personas se empoderan con aplicaciones inteligentes para guiar las decisiones de salud y las elecciones de estilo de vida. A medida que esto sucede, existe una desconexión significativa entre las herramientas de salud y bienestar que los consumidores están utilizando y los sistemas de salud tradicionales. Esta «desconexión» ha evolucionado por dos razones.

En primer lugar, los sistemas de salud tradicionales se centran en la gestión de enfermedades y dolencias utilizando vías de atención prescritas en lugar de centrarse en los objetivos individuales de salud y bienestar.

En segundo lugar, la mayoría de las herramientas y plataformas digitales disponibles para los consumidores no están conectadas a las infraestructuras de información de los sistemas de salud tradicionales. Esto hace que sea casi imposible para los consumidores y proveedores de salud conectarse y colaborar.

La aparición de la IA proporcionará un doble beneficio. Ya está mejorando el enfoque actual de gestión de enfermedades de los sistemas de salud en la actualidad. Más importante aún, cuando las aplicaciones inteligentes de salud del consumidor están conectadas a los sistemas tradicionales de datos de salud, potenciarán nuevas estrategias proactivas y predictivas que se centran en mantener a las personas sanas y cuidarlas de manera más efectiva cuando no lo están. Hacer que la salud personalizada sea real Más allá de ser reactiva, la salud tradicional sigue en gran medida un enfoque único para todos. En realidad, no hay dos consumidores iguales, incluso si tienen una enfermedad crónica común.

Cada uno de nosotros tiene un conjunto único de características, incluida nuestra composición genética, microbioma, edad, sexo y muchas otras variables que afectan nuestra salud. Uno de los beneficios de la creciente gama de soluciones de IA es acceder y analizar enormes cantidades de datos de registros médicos, dispositivos de diagnóstico personal, estudios de investigación y otras fuentes como datos determinantes sociales. Cuando estas capacidades se combinan con la sabiduría, la experiencia y la capacitación de los médicos, los resultados incluyen predicciones, diagnósticos y tratamientos más precisos que se adaptan a la medida del individuo.

Lo que los sistemas de salud tradicionales a menudo pasan por alto al priorizar la salud y el bienestar de las personas o las poblaciones es una comprensión de las motivaciones y los objetivos de quienes recurren a ellos. Los consumidores exigen cada vez más atención personalizada según sus valores, necesidades y circunstancias de vida únicas.

La Revolución de la Salud Inteligente proporcionará a los profesionales de la salud las herramientas que necesitan para personalizar la atención, cambiando el enfoque al paciente, no a la enfermedad. A medida que miramos hacia el futuro en las posibilidades de mejorar la salud y los servicios médicos al solicitar la ayuda de la IA, me acuerdo de lo que se conoce como la ley de Amara (acreditada a muchos, pero originalmente acuñada por Roy Amara, ex presidente del Instituto del Futuro). Dice: «Tendemos a sobreestimar el efecto de una tecnología a corto plazo y subestimar el efecto a largo plazo.» – Ley 16 de Amara   Estamos en las primeras etapas del surgimiento de la Revolución de la Inteligencia en la salud.  Lo mejor  está por delante.